甘薯作为世界上重要的粮食、饲料、生物质能源和工业原料用作物之一,按照联合国粮农组织2013年数据,我国是世界上最大的甘薯生产和消费国,占世界总产量的71%。随着甘薯市场需求旺盛,国家和地区间的不规范引种种植,导致了甘薯各种病害的蔓延,呈现南病北移,北病南移,老病新发的现象,危害逐年加重,对甘薯生产带来了新的威胁。2006年以来在我国多个省份出现了一种危害甘薯茎基部的病害,典型症状为从茎基部发病,造成整株或部分枝条迅速腐烂、倒伏,最后死亡。该病与已往报道的以甘薯茎基部腐烂病不同,该病害在我国发生及危害程度日益严重。因此,本研究通过在多地采集病样分离病原菌,对该病害进行了详细的研究,主要结果如下:(1)从广东、广西、福建、河南和重庆等省市采集茎腐病病样分离病菌,病菌经柯赫氏法则验证,以及形态特征、生理生化与16SrDNA序列分析鉴定,明确了引起该病害的病原菌为达旦提狄克氏菌Dickeya dadantii(旧分类系统Erwinia chrysanthemi),确认是我国一种新的甘薯细菌性病害-甘薯茎根腐烂病(bacterial stem and root rot,简称茎腐病)。(2)采用REP-PCR指纹分析方法对来自6个地域的59个病原菌菌株进行遗传多样性分析,共扩增出41个清晰的条带,其中36个为多态性条带,每对引物的扩增条带数在4-10之间,平均为7.2。在种群水平上,有效等位基因数(Ne)、Nei基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)分别为1.7805、1.4768和0.2801,结果表明甘薯茎腐病菌群体中存在丰富的遗传多样性,且不同地域的病菌群体存在明显的差异,其中湛江菌株的群体多样性最高,南宁菌株的群体多样性最低。(3)根据遗传距离和遗传相似系数对各群体进行UPGMA聚类分析,当遗传相似系数为0.80时,从6个不同地区获得的59个甘薯茎腐病菌株被分为5个类群。类群Ⅰ由广州群体(10个菌株)和湛江群体(3个菌株)聚为一类;类群Ⅱ由6个菌株组成,全部来自湛江种群;类群Ⅲ由南宁和合浦群体聚为一类;类群Ⅳ由东兴群体的10个菌株组成;类群V由万州群体的10个菌株构成。结果表明采用分子方法划分的遗传类群与菌株来源地域有一定的相关性。(4)利用薯片接种方法,将来自7个地域的62个菌株接种9个甘薯品种进行分析,发现不同地域群体之间存在明显的致病差异,其中致病性最强的是合浦群体与湛江群体,致病性差的为万州群体;不同菌株间也存在显著的致病力差异,其中致病力最强是来自南宁种群的菌株E59,致病力最小则是来自万州种群的菌株E173。可见,甘薯茎腐病菌(D.dadantii)不同地域群体间存在明显的致病差异及分化。(5)采用穿刺接种方法以甘薯茎部作为接种部位对1355份甘薯种质资源进行了茎腐病抗性鉴定,其中高抗材料75份,抗病材料83份,中抗材料229份,感病材料284份,高感材料684份,表明我国国内甘薯资源的茎腐病抗性多样性程度很高,蕴藏着十分丰富的抗病基因源,为茎腐病抗病育种提供参考。此外,也发现接种的甘薯部位不同其抗病表型截然相反,例如,采用茎枝接种广薯87表现为中抗,采用薯片接种广薯87表现为感病。(6)以甘薯抗病品种广薯87材料,对接种茎腐病菌后0h、3 h、9h、18h和24 h时间点的茎部进行数字表达谱分析。测序原始序列经去除含adaptor和低质量reads,样本R0、R3、R9、R18、R24获得的Clean Reads 分别为7623245个、8380087个、7616466个、7915727个和6954337个。其中60%的Clean Reads能够map到参考基因,分别注释了54193个,57583个、57451个、56098个和53222个基因。与接种Oh相比,广薯87接种茎腐病菌后3 h的差异表达基因数为2891,其中上调表达基因2167个,下调表达基因724个;接种后9 h的差异表达基因数为7054,其中上调表达基因4825个,下调表达基因2229个;接种后18 h的差异表达基因共有9736个,其中上调表达基因3193个,下调表达基因3135个;接种茎腐病菌后24 h的差异表达基因数为6328,其中上调表达基因3193个,下调表达基因3135个。广薯87接种茎腐病菌后不同时间点有581个共同差异表达基因。(7)以甘薯感病品种广紫薯2号为材料,对接种茎腐病菌后Oh、9 h和18 h时间点的茎部进行数字表达谱分析。测序原始序列经去除含adaptor和低质量reads,样本S0、S9和S18获得Clean Reads 分别为8624410个,8618610个和8615650个。其中60%的Clean Reads能够map到参考基因,分别注释了55813个、56093个和54549个基因。与接种Oh相比,广紫薯2号接种茎腐病菌后9 h的差异表达基因数为488,其中上调表达基因24个,下调表达基因464个;接种后18 h的差异表达基因数为2422,其中上调表达基因1013个,下调表达基因1409个。广紫薯2号接种茎腐病菌后不同时间点有259个共同差异表达基因。(8)对所有差异表达基因的GO功能分类注释,抗病品种共查询到47个GO分类条目,感病品种共查询到44个GO分类条目。所有GO分类条目涉及细胞组件(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物过程(biological process)等功能,其中生物学过程所占的比例接近一半,可见其在寄主受侵染过程中起主要的作用。KEGG分析表明,差异表达基因参与了抗病相关代谢通路,包括植物与病原菌互作途径(Plant-pathogen interaction)、苯丙氨酸代谢途径(Phenylalanine metabolism)、苯丙烷生物合成途径(Phenylpropanoid biosynthesis)、植物激素信号转导途径(Plant hormone signal transductio)、类黄酮生物合成途径(Flavonoid biosynthesis)和过氧化物酶体途径(Peroxisome)等。可见,茎腐病菌侵染引发了甘薯的多种抗病途径、涉及防御反应及信号转导等,表明抗茎腐病的分子机制受到多基因网络系统的调控。抗病品种广薯87接种茎腐病菌后,参与的抗性相关代谢途径及差异表达基因数量明显多于感病品种广紫薯2号接种后的差异表达基因数量。总之,应答茎腐病菌的基因表达谱分析,有助于挖掘抗病候选基因,以及研究这些基因在甘薯抗茎腐病菌互作中的作用。