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1.研究背景原发免疫性血小板减少症（Primary immune thrombocytopenia,ITP）是一种以血小板过度破坏和血小板生成减少为特征的自身免疫性疾病,成人ITP的患病率约为10/105[1],发病率为1.6-3.9/105/年[2]。ITP患者B细胞可以产生针对自身血小板的自身反应性抗体,ITP患者体内血小板破坏主要由IgG抗体介导。抗血小板抗体可以通过补体依赖的细胞毒性参与血小板破坏[3,4],也可以作用于巨核细胞,影响巨核细胞的成熟、分化及血小板的生成[5,6]。利妥昔单抗通过与B细胞特异性表达的CD20相结合诱导B细胞裂解[7],但有超过40%的患者对利妥昔单抗治疗无反应[8],因此寻求调节B细胞自身免疫反应的新靶点对ITP的治疗具有重要意义。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为机体主要的抗原呈递细胞[9]。ITP患者单核细胞源性树突状细胞（monocytes-derived dendritic cells,moDCs）能够吞噬凋亡血小板并刺激自身抗原反应性B细胞产生[10],提示DCs功能异常可能是ITP发生的重要因素,但其具体机制尚不明确。综上所述,本研究共分为2个部分。第一部分中,旨在利用转录组测序技术寻找调节ITP患者B细胞免疫反应的关键分子通路,探讨特异性分子靶向药物是否可以改善ITP患者B细胞自身免疫反应及其机制。第二部分中,通过对ITP患者moDCs进行转录组测序,探讨树突状细胞在ITP异常免疫反应中的作用及其机制,以期为ITP患者寻找新的治疗策略。2.研究目的（1）第一部分①通过检测ITP患者外周血B细胞分化状态、分化转录标志物、抗体分泌和抗原呈递共刺激分子,明确ITP患者外周血B细胞的免疫功能异常。②利用转录组测序技术,对ITP患者与正常人外周血B细胞进行生物信息学分析,寻找调节ITP患者B细胞免疫反应的关键分子通路。③探究特异性分子靶向药物对改善ITP患者外周血B细胞免疫功能异常的作用及机制。（2）第二部分利用转录组测序技术,对ITP患者与正常人moDCs进行生物信息学分析,寻找调节ITP患者moDCs免疫功能的关键分子通路。3.研究方法（1）第一部分①纳入24例单克隆抗体特异性血小板抗原固定实验阳性的ITP患者及性别、年龄相匹配的健康志愿者,分为ITP组和正常组,采用流式细胞术、聚合酶链式反应、酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析两组人群B细胞分化状态、分化转录标志物、抗体产生能力和抗原呈递共刺激分子的表达。②收集选取4例ITP患者及5例性别、年龄相匹配的健康志愿者外周血样本,分选CD19+B细胞进行转录组测序。③根据差异基因分析和富集分析结果,确定ITP患者外周血B细胞中表达异常的信号通路-mTOR信号通路,并采用蛋白免疫印迹和Protein Simple Wes技术验证mTOR信号通路在ITP患者外周血B细胞中表达情况。④采用CellTiter-Glo确定mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素和mTORC1/mTORC2双重抑制剂Torin1对B细胞的半抑制浓度。加入1μg/ml CD40L、10ng/ml rhIL-4、2.5μg/ml CpG、1nM雷帕霉素或Torin-1培养CD19+B细胞,采用流式细胞术、聚合酶链反应和ELISA检测B细胞分化状态、分化转录标志物、抗体分泌和抗原呈递共刺激分子的表达。（2）第二部分①收集选取3例ITP患者及3例性别、年龄相匹配的健康志愿者外周血样本,分选CD14+单核细胞并在含有100ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和50ng/ml白介素4的RPMI 1640培养基中培养5天,随后加入1μg/ml脂多糖继续培养2天以诱导moDCs成熟。②采用Trizol试剂提取细胞总RNA,采用琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度仪检测RNA完整性和纯度,并选取浓度大于0.2μg/ml,OD260/280在1.9-2.1之间的样品进行转录组测序。RNA文库构建、质检及转录组测序由北京诺禾致源科技有限公司使用Illumina Hiseq 平台完成。③根据差异基因分析和富集分析结果,确定ITP患者moDCs中表达异常的信号通路-mTORC1信号通路,并采用蛋白免疫印迹技术验证mTORC1信号通路在ITP患者moDCs中的表达情况。4.研究结果（1）第一部分①ITP患者外周血B细胞存在免疫功能亢进。ITP患者外周血中CD27+CD38+细胞（浆母细胞）比例显著增加,BLIMP1和IRF4的表达显著增加。ITP患者血浆中IgG和IgM抗体显著增多,且B细胞抗原呈递共刺激分子CD80和CD86表达增加。②生物信息学分析显示,ITP患者外周血B细胞基因富集于BP条目中的“靶向内质网蛋白”、“蛋白质内质网定位”、“核转录mRNA分解代谢”和MF条目中的“核糖体结构”,并富集于“核糖体”、“氧化磷酸化”和“蛋白质在内质网的加工”等KEGG条目。GSEA分析结果显示,ITP患者外周血CD19+B细胞mTOR信号通路基因表达显著上调。验证结果表明,ITP患者外周血B细胞磷酸化mTOR（p-mTOR）、磷酸化S6K（p-S6K）和磷酸化Akt（p-Akt）表达显著上调。③1nM雷帕霉素处理的B细胞中,mTORC1信号通路受到强烈抑制,p-S6K表达显著降低,而p-Akt表达无显著变化。雷帕霉素可以减少浆母细胞的比例,抑制B细胞中BLIMP1和IRF4的表达,并显著减少细胞培养上清中IgG和IgM的含量。同时雷帕霉素可以抑制抗原呈递共刺激分子CD80和CD86的表达。④1nM Torin1可以降低ITP患者外周血B细胞中mTORC1和mTORC2的磷酸化水平,导致p-S6K和p-Akt显著降低,Troin1和雷帕霉素对mTORC1的抑制作用无显著差异。Torin1可以减少浆母细胞的比例,抑制BLIMP1和IRF4的表达,并显著减少细胞培养上清中IgG和IgM的含量。Torin1也可以降低B细胞表面CD80和CD86的表达。（2）第二部分①GO富集分析结果表明,ITP患者moDCs差异基因主要集中在T细胞分化、T细胞共刺激、T细胞活化等生物学过程。KEGG富集分析显示,差异基因集中在T细胞受体信号通路、造血细胞谱系、细胞因子-受体相互作用等相关信号途径中,同时有10个基因注释在自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路中。②GSEA分析显示,ITP患者moDCs中mTORC1信号通路基因表达显著上调,此外,包括糖酵解、炎性因子反应性和对干扰素γ的反应3个相关信号通路的基因集在ITP患者moDCs中显著上调。③Western blot结果表明,ITP患者moDCs中p-mTOR表达显著升高,且mTORC1信号通路的活化标志物S6K磷酸化水平显著升高。5.研究结论（1）第一部分①ITP患者外周血B细胞存在免疫功能亢进。②ITP患者外周血B细胞中mTOR信号通路高度激活,mTOR信号通路可能是调控ITP患者B细胞免疫功能的重要靶点。③雷帕霉素可以通过抑制mTORC1活性抑制B细胞向浆母细胞分化,并抑制B细胞转录分化标志物的表达和抗体分泌,抑制抗原呈递共刺激分子的表达。④Torin1可以通过抑制mTORC1和mTORC2活性抑制B细胞向浆母细胞分化,并抑制B细胞转录分化标志物的表达和抗体分泌,抑制抗原呈递共刺激分子的表达。但雷帕霉素和Torin1对ITP患者外周血B细胞分化状态、分化转录因子表达、抗体分泌和抗原呈递共刺激分子的调节作用无明显差异。（2）第二部分ITP患者moDCs可能通过mTORC1信号通路介导的T细胞和NK细胞免疫功能调节参与ITP发病过程,mTORC1信号通路可能是调节ITP患者moDCs功能异常的新靶点。