陆地棉体细胞胚胎发生和植株再生体系的建立

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随着基因工程和分子生物学的发展,转基因技术正广泛地应用于现代育种,使植物育种能够实现分子设计,将外源有益基因导入受体植物细胞,并使其定向而稳定地遗传。建立高效而稳定的植物遗传转化体系,是保证植物转基因获得大量可供筛选群体的前提条件。因此,建立高效的棉花体细胞胚胎发生和植株再生体系,对于棉花基因工程、功能基因组和现代棉花育种具有重要的意义。本研究以珂字棉201、珂字棉312、豫早1号等陆地棉品种为研究材料,系统地研究和优化陆地棉体细胞培养过程中的各种条件,建立培养周期短、再生频率高,简便易掌握的棉花体细胞培养植株再生体系,并研究色素腺体和外源基因对于陆地棉体细胞培养的效果,主要结果如下: 1、通过对多种激素及其配比、碳源、不同凝固剂和灭菌时间对愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导和分化效应进行了研究,结果表明,0.05mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT这一激素配比最适合诱导愈伤组织;不同激素处理下胚胎发生效果不同,激素IBA和KT组合最利于胚胎发生,2,4-D效果最差。在一定范围内,激素用量增加,出愈率提高,但胚胎发生率降低。因此降低激素(2,4-D)的浓度有利于胚胎发生。在胚胎发生和植株再生中,以葡萄糖作为碳源其培养效果(再生苗率及再生苗的质量)明显优于以蔗糖。 2、凝固剂和培养基灭菌条件比较结果表明,棉花在愈伤组织诱导和增殖、胚性愈伤组织的诱导和增殖和胚状体的萌发过程中,使用phytagel(植物凝胶)作为凝固剂的效果远优于使用琼脂作为凝固剂;而最经典的高压灭菌对于棉花体细胞培养来讲并非是最好的,培养基灭菌14min对于微生物灭菌已足够,但对于培养基的有效成份的破坏作用较小。因此,改良的灭菌方法对于棉花的出愈率、愈伤组织生长、胚状体形成和植株再生等均显著优于经典的灭菌方法。 3、用珂字201、珂字312和豫早1号三个品种进行验证后,建立了适用基因型广,培养时间短的棉花体细胞培养再生体系,其关键技术包括:(1)基本培养基为MS无机盐+B5有机元素+1.0g/L Gln+0.5g/L Asn,其中愈伤组织诱导时在基础培养基中外加0.1mg/L 2,4-D和0.1mg/L KT,继代培养基与愈伤组织诱导培养基基本相同,只是将2,4-D降至到0.05mg/L,分化培养基的激素配
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