背景:缺血性心血管疾病,尤其是心肌梗死（Myocardial infarction,MI）严重威胁人类健康。针对MI后引发的心脏重构及心衰进展,目前药物、冠状动脉内支架植入术、冠状动脉旁路移植术等治疗虽取得了良好的治疗效果,但MI后仍然存在相当部分的心肌细胞丧失,心室不良重构以及心功能恶化。研究发现,表观遗传在MI后心脏保护中发挥重要作用。目前关于表观遗传与心脏重构之间的研究主要集中在DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰层面。而RNA表观转录后修饰的研究相对较少。新近研究显示RNA表观转录后修饰目前已发现150种类型,包括N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）、N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine,m1A）、N5-甲基胞嘧啶（N5-methylcytidine,m5C）、4-乙酰化胞嘧啶（N4-acetylcytidine,ac4C）等等。其中,m6A是最常见的真核生物内部mRNA修饰的主要类型。研究表明,在MI后心衰小鼠中,m6A去甲基化酶分子肥胖基因（Fat mass and obesity,FTO）通过下调m6A可改善缺血后心脏功能;m6A甲基化酶甲基转移酶样3（Methyltransferase-like 3,METTL3）可调节心肌肥大并促进心功能恶化。可见mRNA甲基化修饰在心脏病领域发挥着重要作用。然而,在心血管疾病中关于m1A甲基化修饰的研究尚未见报道。我们推测,与m6A修饰类似,m1A修饰可能在心脏疾病中亦发挥重要作用。由此,我们对人缺血性心衰心肌组织实施了m1A甲基化免疫共沉淀测序试图揭示人类心脏的m1A甲基化修饰图谱。我们同时在鼠缺血性心衰心脏中,检测了心肌梗死后不同时间点m1A及其甲基化修饰相关酶的表达,并筛选出去甲基化酶Alk B同源物3（Alk B homolog 3,ALKBH3）,其基因水平总体显著上调,且随心梗时间延长,呈持续上调状态。为进一步探索ALKBH3依赖的m1A修饰对MI后心脏的修复作用,我们在MI小鼠体内注射了ALKBH3抑制剂进一步观察了其对MI后心脏保护的功能表型。本研究揭示了人类心力衰竭的心脏m1A甲基化修饰图谱,并对m1A修饰的关键酶ALKBH3在缺血心脏中的保护作用进行了初步探索。本研究的实施将为靶向RNA表观转录后修饰作为缺血性心脏病的诊疗提供潜在的理论依据及实验补充。第一部分缺血性心衰心脏中m1A甲基化修饰图谱改变目的:对人缺血性心衰的心脏组织进行了RNA甲基化免疫沉淀测序（methylatedRNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq）及数据分析,揭示人的正常及缺血性心衰心脏中m1A甲基化修饰图谱改变。方法:1.MeRIP测序:使用NanoDrop ND-1000仪测量每个样品的RNA浓度,采用Qubit3.对RNA定量及分析。GenSeq TM m1ARNA IP试剂盒（GenSeq）进行m1ARNA免疫沉淀反应。NEBNext?Ultra II DirectionalRNA Library Prep试剂盒对InputRNA样品,以及免疫沉淀后的IPRNA样品进行RNA测序文库构建。通过Bio Analyzer2100分析仪进行文库质检。在Illumina Novaseq 6000测序仪进行高通量测序。经过Illumina Novaseq 6000测序仪测序,图像分析,碱基识别和质控后,产生原始reads。对差异甲基化的编码基因进行GO和Pathway分析。2.mRNA测序:RNA定量质控、完整性质控和文库质量丰富MeRIP测序。用Ribo-Zero rRNA Removal Kits移除总RNA中的rRNAs,使用Tru Seq Stranded TotalRNA Library Prep Kit预处理RNA,构建测序文库。使用Bio Analyzer 2100仪器进行文库质控和定量。根据Illumina测序说明,将10 p M文库变性为单链DNA分子,在Illumina Nova Seq 6000测序仪上进行测序。结果:通过MeRIP-seq测序分析显示,在正常心脏和缺血性心衰心脏中mRNA m1A的整体分布和m1A峰富集的分布没有明显的差别,两者都主要分布在编码序列区（Coding sequence,CDs）,在起始密码子端附近m1A峰显著富集,3’非翻译区（3’Untranslated regions,3’UTR）区富集最少。相对于正常心脏组织,缺血性心衰心肌mRNA m1A甲基化修饰发生了显著变化。人心脏组织在正常和缺血性心衰两种状态下其mRNA m1A甲基化修饰均有特异性的富集,且m1A甲基化修饰差异程度大。GO/KEGG功能富集分析显示,mRNA m1A甲基化修饰发生了显著差异变化的转录本的功能与心肌收缩功能、氧化应激及心肌纤维化等相关。结合发生显著差异变化的mRNA和mRNA m1A分析提示,在缺血性心衰中同时出现mRNA表达水平显著差异改变及其m1A甲基化修饰显著差异改变的部分相对较少。显著差异表达的mRNA GO/KEGG功能富集分析显示,这些mRNA的功能主要与心肌收缩、心肌能量代谢、炎症、纤维化和细胞凋亡相关。结论:人缺血性心衰发生后,心肌m1A甲基化修饰图谱发生了显著变化,m1A富集到的转录本功能与调节关键的心肌收缩功能、氧化应激及心肌纤维化等生物学过程相关。第二部分ALKBH3对大鼠心肌梗死后心脏修复功能研究目的:检测m1A在MI后的修饰变化,筛选MI后介导m1A修饰改变的关键酶,探索ALKBH3抑制剂对MI后心脏修复的影响。方法:1.m1A和m1A甲基化修饰相关酶检测:动物实验分组:假手术组（n=6）和心肌梗死组（n=6）。我们通过建立SD大鼠心肌梗死模型,分别取假手术组和心肌梗死组AMI后4小时、1天、2天、3天、7天、14天和28天缺血心肌组织进行RT-q PCR和Wester blot实验检测m1A甲基化修饰相关酶基因和靶分子蛋白的表达。Dot blot实验检测上述不同时间点心肌梗死组织中m1A表达。2.ALKBH3抑制剂对MI后心脏修复的功能影响:本部分实验分组:假手术组,心肌梗死组和心肌梗死加HUHS015组。我们通过建立昆明小鼠心肌梗死模型,在建模后48小时,通过模型鼠项背部皮下注射HUHS015 32 mg/kg,每日1次,连续7天,干预后28天取心肌组织进行masson染色,显微镜下观察心肌纤维化变化,用Image J软件定量分析心肌纤维化。结果:1.m1A在心肌梗死心脏中的表达:心肌梗死组织中不同时间点m1A的表达呈现明显动态变化,急性心肌梗死后第1天和第2天最高,与对照组比较明显上调（P<0.05）,第三天开始持续下降,其中第28天降至最低,与对照组比较第3、7、14和28天明显下调（P<0.05）。结果表明随着MI后m1A水平发生了动态改变,且时间延长,总体上呈下调趋势。2.心肌梗死后心脏RNA m1A甲基化修饰相关酶TRMT6、TRMT61A、ALKBH1、ALKBH3和BMT2基因表达水平发生了动态改变,其中ALKBH3表现出显著规律变化,即MI后1天降低,2天后降至最低,与对照组比较降低（P<0.05）,第三天开始持续升高,与对照组比较第14和28天明显升高（P<0.05）。3.ALKBH3蛋白的在MI心脏中的表达:心肌梗死组织中不同时间点ALKBH3的表达亦呈现明显动态改变,急性心肌梗死后第1和第2天后降至最低,与对照组比较有统计学意义（P<0.05）,第三天开始持续升高,其中与对照组比较第7、14和28天显著上调（P<0.05）。ALKBH3的动态改变与m1A表达水平呈负相关。4.抑制ALKHB3的作用后心肌梗死心脏纤维化改变:对心肌组织进行masson染色及Image J软件定量分析心肌纤维化,对比分析发现,相比心肌梗死组,心肌梗死加HUHS015组的心肌纤维化明显减少（P<0.05）,这表明抑制ALKHB3的作用能促进MI后心脏修复。结论:1.在心肌梗死后,心肌中RNA m1A、ALKBH3的mRNA和ALKBH3蛋白表现出规律改变,三者之间改变呈对应调节关系。2.抑制m1A去甲基化酶ALKBH3的活性可改善心肌纤维化,促进心脏功能的修复。