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肠道细菌感染为常见的消化道疾病。致病菌大多是革兰阴性菌，通常引起腹泻、腹痛、发热甚至引起全身性感染。目前针对肠道细菌感染主要是使用抗生素进行抗菌治疗。但随着抗生素的不合理应用、滥用以及口服抗菌药物应用的增多，消化道致病菌的耐药性问题正变得日益严重。对于耐药性细菌肠道感染的治疗，新型抗菌药物的开发和应用变得尤为重要。
抗菌肽（antimicrobial peptide）是一类具有抗菌活性的多肽，在生物体的天然免疫中起着重要作用。抗菌肽具有广谱、高效抗菌活性，与其他抗菌药物多无交叉耐药性，而且不易诱导耐药菌株的产生。研究发现，抗菌肽Bactenecin7（Bac7）对革兰阴性菌具有高效抗菌活性，除直接杀菌作用外，Bac7还有中和内毒素、抗炎、免疫诱导、组织修复等功能。显然抗菌肽Bac7在肠道细菌感染治疗中具有众多优势，有望成为治疗革兰阴性细菌引起的肠道感染的新一代抗菌药物。
研究目的:
构建携抗菌肽Bac7基因的表达载体并在乳酸乳球菌中高效分泌表达，为抗菌肽Bac7治疗肠道革兰阴性菌感染的合理安全应用提供理论与实验依据。同时构建携抗菌肽Bac7基因的乳酸乳球菌MG1363（L。Lactis MG1363）的同源重组载体，为进一步研究转抗菌肽Bac7基因乳酸乳球菌治疗肠道感染奠定基础。
研究方法:
1.抗菌肽Bac7分泌表达载体的构建：根据乳酸乳球菌对密码子的偏爱性和Genbank中Bac7蛋白序列，设计并化学合成Bac7基因序列以及分泌信号肽（SPUSP）序列和增强表达序列（Leisstcda）的拼接引物，采用重叠延伸PCR方法，拼接合成Bac7基因及其相关调控元件序列，并将其克隆至载体pMG36e中构建重组载体pMG36e-Bac7。
2.抗菌肽Bac7抗血清的制备：利用软件DNASTAR预测抗菌肽Bac7的抗原决定簇，采用化学合成法合成其抗原决定簇序列（N-端20个氨基酸）。将合成的多肽与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联、纯化后免疫家兔。制备的抗血清经盐析纯化后用SDS-PAGE和ELISA方法进行抗体的纯度和滴度测定。
3.L.lactis MG1363的电击转化：通过试验确定最适电转化条件，并在此条件下将重组质粒pMG36e-Bac7电击转化至L.lactis MG1363中。挑取单菌落增菌后提取质粒进行PCR鉴定，进一步将质粒转化至大肠杆菌DH5α中，提取质粒做双酶切鉴定。
4.抗菌肽Bac7基因在L.lactis MG1363中的分泌、表达情况分析：采用RT-PCR方法检测Bac7基因在转录水平的表达。通过Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析Bac7基因在L.lactis MG1363中的表达、分泌情况。
5.表达产物生物活性的初步检测：采用超滤离心法将L.lactisMG1363培养液上清中表达产物进行浓缩。琼脂扩散法检测浓缩上清中抗菌肽Bac7对大肠杆菌和阴沟肠杆菌的抑菌活性。
6.携Bac7基因的L.lactis MG1363同源重组载体的构建：根据L.lactis MG1363基因组中的胸腺嘧啶合成酶基因（thymidylate synthase gene，ThyA）序列设计引物，以L.lactis MG1363基因组DNA为模板，PCR扩增ThyA基因起始密码上游及下游各约1000bp左右的碱基序列，并将其依次克隆至载体pMUTIN4中，再将Bac7基因插入载体多克隆位点构建出同源重组载体pThyA-Bac7。
研究结果:
1.经重叠延伸PCR方法成功拼接合成Bac7及其相关调控元件序列并将其克隆至载体pMG36e，构建了重组载体pMG36e-Bac7，经双酶切鉴定并进一步测序确证，结果显示目的基因与设计序列完全一致。
2.成功制备了兔抗Bac7多克隆抗体，抗体经盐析纯化后进行SDS-PAGE，电泳结果显示制备的抗体纯度较高。进一步用ELISA方法测定抗体效价，效价达1：10000。
3.初步确定了L.lactis MG1363最适电转化参数：电压10kV/cm，电阻200Ω，电容25μF，电击时间5.0ms。通过电击成功地将重组质粒导入L.lactis MG1363中。RT-PCR、Western blot检测结果表明，抗菌肽Bac7可有效表达，并分泌于L.lactis MG1363培养液上清中。
4.琼脂扩散法检测结果证明，表达产物抗菌肽Bac7在体外能有效抑制大肠杆菌和阴沟肠杆菌的生长。
5.成功构建了L.lactis MG1363同源重组载体pThy-Bac7，经双酶切鉴定和进一步测序鉴定，结果与预期完全一致。
研究结论:
1.携重组质粒pMG36e-Bac7的L.lactis MG1363能有效表达、分泌抗菌肽Bac7，表达分泌于培养液上清的抗菌肽Bac7在体外能有效杀灭大肠杆菌和阴沟肠杆菌。
2.成功制备了抗菌肽Bac7多克隆抗体。
3.成功构建了携抗菌肽Bac7基因的L.lactis MG1363同源重组载体pThy-Bac7，为实现Bac7基因在乳酸菌中的整合型表达奠定了基础。