番茄是全世界消费量较高,栽培最为普遍的蔬菜作物之一,由灰霉菌引起的番茄灰霉病是造成番茄减产、品质下降的一种世界性重要病害,该病害已成为限制番茄高产、高质的主要因素之一。几丁质酶可水解大多数真菌细胞壁的主要成分几丁质,因而具有广谱抗真菌性,目前被广泛应用于植物抗真菌病害基因工程育种,培育抗真菌病害作物新种质。本研究构建了35S启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1的植物表达载体pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1,采用农杆菌介导的愈伤转化和茎尖转化两种转化方法导入Micro-Tom番茄中,通过筛选鉴定获得转基因植株,对其灰霉菌抗病性进行了分析。取得以下研究结果:1构建EuCHIT1植物表达载体及遗传转化番茄本研究以pCAMBIA1301为最初载体,采用一步克隆法构建了35S启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1表达元件、Hyg为筛选标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1。酶切及PCR验证后将其导入根癌农杆菌LBA4404,采用愈伤遗传转化方法转化番茄,筛选鉴定获得38株转基因植株。采用茎尖遗传转化方法转化番茄,PCR鉴定获得12株转基因植株。2 EuCHIT1基因表达对番茄几丁质酶活性的影响采用蜗牛酶法,对野生型和转EuCHIT1番茄植株中几丁质酶活性进行分析,结果表明,转EuCHIT1番茄植株中几丁质酶活性为2059.48 U·g-1,比野生型高62.14%。说明EuCHIT1基因在番茄中的表达可以增加番茄植株中几丁质酶活性。3 EuCHIT1基因表达对番茄灰霉病抗性的影响采用离体叶片接种法,对野生型和转EuCHIT1番茄接种灰霉菌,分析其发病时间和病斑大小。结果表明,野生型番茄叶片在接菌2 d后出现水浸状病斑,而转EuCHIT1番茄叶片在接菌4 d后才开始出现病斑。转EuCHIT1番茄叶片不仅发病时间比野生型推迟3 d,且在接菌4 d后,转EuCHIT1番茄叶片病斑直径平均为6.93 mm,而野生型叶片病斑直径平均为9.4 mm,转EuCHIT1番茄叶片上的病斑直径比野生型小26.28%。说明EuCHIT1在番茄中的表达提高了番茄对灰霉病的抗性。4 EuCHIT1基因表达对番茄保护性酶活性的影响分别对未接种和接种灰霉菌6 d后的野生型和转EuCHIT1番茄SOD、POD、CAT活性和MDA含量分析表明,接菌前,转EuCHIT1番茄植株中POD活性为2825.85 U·g-1(FW),比野生型高48.63%;MDA含量为21.84 nmol·g-1(FW),比野生型低28.25%;而SOD和CAT活性与野生型相比无显著差异。接菌后,转EuCHIT1番茄植株中SOD、POD和CAT活性为510.44 U·g-1(FW)、5423.92U·g-1(FW)和603.59 U·g-1(FW),分别比野生型高19.48%、116.08%和53.80%;MDA含量为26.49 nmol·g-1(FW),比野生型低37.65%。说明EuCHIT1基因在番茄中的表达增强了番茄植株的抗氧化能力,从而减少灰霉病对番茄的损伤。5 EuCHIT1基因表达对番茄病程相关蛋白基因表达的影响对野生型和转EuCHIT1番茄接种灰霉菌,以番茄Clathrin adaptor complexes(CAC)基因作为内参,接菌6d后对接菌前、后野生型和转EuCHIT1番茄病程相关蛋白基因PR-1a、PR-2、PR-NP24和PR-5 Real-time PCR分析表明,接菌前,转EuCHIT1番茄中PR-1a、PR-2和PR-5基因表达量均高于野生型,分别为野生型的2.23倍、11.69倍和1.80倍,PR-NP24表达量与野生型无显著差异;接菌后,转EuCHIT1番茄的PR-1a、PR-2、PR-NP24和PR-5表达量也均极显著高于野生型,分别是野生型的4.35倍、10.37倍、16.58倍和5.02倍。表明EuCHIT1基因在番茄中的表达可以提高番茄植株中病程相关蛋白基因的表达,从而增强转基因番茄植株的抗病性。