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本文通过生理生化及分子生物学的实验手段,对矿质营养在烟草感染病毒过程中的作用进行了系统研究。探索了矿质营养在烟草与TMV、CMV相互作用过程中,防御酶系、光合作用、戊糖磷酸途径等相关指标的影响,系统地研究了矿质营养对烟草抗病性的作用,以及感染病毒后烟草对矿质营养的吸收动态,同时从分子生物学角度对烟草钙信使系统以及烟草抗病信号通路的锌营养调控的机理进行了深入研究。结果如下:
1、研究明确了最适烟苗生长及烟苗抗性生理生化指标良好的离子浓度。在保证烟草幼苗正常生长的浓度范围内,采用镁、铁、锰、铜、锌五种矿质营养不同离子浓度处理后,对烟草幼苗的生长及其生理生化指标研究。表明,采用单因子Zn(0.1mg/L,)和Fe(1.68mg/L)处理对烟草幼苗生长有较强的促进作用,离子处理后烟草幼苗生长状况较好,生理生化及抗性指标均明显好于其它锌、铁离子浓度处理。
2、研究明确不同营养状况下,烟草在分别感染TMV、CMV后,发病程度及增殖情况,其中Zn(0.1mg/L)和Fe(1.68mg/L)处理后,感病烟草发病较轻,并且对TMV、CMV均有较好的抗性。采用生物学方法及间接ELISA方法检测其病毒浓度较低。表明在上述营养状况下,有利于烟草自身抗病性的提高,可以明显降低病毒对其造成的破坏作用,延缓症状出现、减轻发病程度。
3、系统研究了矿质元素不同离子浓度处理后,对烟草防御酶系、光合作用及其超微结构、戊糖磷酸途径、Mg<2+>-ATPase活性和病程相关蛋白等相关指标的影响,探索了矿质营养对烟草抗病性的作用。结果表明,Zn(0.1mg/L)和Fe(1.68mg/L)处理后,无论单独采用离子处理或是感染病毒,均能激发寄主防御酶系活性及相关抗性指标的提高,使受到病毒侵染的烟草植株光合作用相关指标和G-6-PDH活性,Mg<2+>-ATPase活性等均明显高于其它处理,对感病烟草超微结构的观察,Mg(24mg/L)和Fe(1.68mg/L)处理对维持烟草叶绿体等超微结构的稳定起到一定的作用,减少病毒对寄主所造成的伤害。
4、铁、锰、镁、锌在一定的浓度范围内,对感病烟草根部吸收矿质元素会产生一定的影响,表现在Zn(0.1mg/L)和Fe(1.68mg/L)处理后的烟草在感染TMV、CMV后,对钾、钠元素的吸收有较好的促进作用。
5、初步探明了锌、铁营养对烟草钙信使系统的调控作用。结果表明,与不供锌、铁处理后的烟草相比,Zn(0.1mg/L)和Fe(1.68mg/L)处理的烟草叶片中结合钙的水平较高,游离Ca<2+>的水平较低;同时,可以提高CaM的转录水平,从而使烟草叶片中CaM含量在整个病毒侵染过程中均较高;钙泵(Ca<2+>-ATPase)和钙的受体激酶(NADK)的活性也表现为病毒侵染前后均高于不供锌、铁处理。表明锌、铁离子的加入可以诱导钙信使系统的信号转导,Ca<2+>-CaM信使系统可能与病毒侵染存在着一定的相关性,同时钙泵在降低细胞游离Ca<2+>水平中起到一定的作用,因而在锌、铁营养调控下,烟草自身对病毒可以产生一定的抗病性。
6、明确了锌营养调控对烟草抗病信号通路的影响。分别对zn(0.0mg/L)和Zn(0.1mg/L)处理的烟草幼苗抗病信号通路中NPR1基因和乙烯信号通路的关键性因子ERF1基因进行钓取,本研究采用特异性引物,从烟草总RNA中分别钓取了片段长度为495bp,528bp的NPR1基因和ERF1基因序列,其中ERF1基因与目前已经报道的关于ERF1基因序列相比对,与来源于烟草的ERF1基因序列的同源性是97%。结果表明,锌营养可以诱导Eth信号通路的关键因子ERF1基因的表达,但表达存在着差异,证明锌营养在烟草与TMV互作关系中起到重要的作用,它可以诱导Eth信号通路相关基因的表达,但其诱导表达量的差异有待进一步研究。
7、采用SYBR Green Ⅰ作为荧光染料的Real-time PCR方法,定量检测锌营养调控下烟草PR1基因的诱导表达量。结果表明,各处理均可以诱导SA信号通路引起SAR,但是其下游的PR1基因表达量产生差异,无论是单独采用离子处理还是接种TMV,均表现为Zn(0.1mg/L)处理表达量要明显高于不供锌处理,证明锌营养在烟草与TMV互作关系中,起到重要的作用,锌营养可以调控烟草产生较强的防御反应,从而抵抗病毒对寄主所造成的伤害。
8、采用最适的锌、铁营养作为助剂与本研究室已报道的一种抗病毒生物农药一嘧肽霉素混合使用,对TMV、CMV的抑制作用进行了初步的探讨。对其烟株体内病毒含量采用生物学和间接ELISA方法进行测定,表现为ZnSO<,4>和FeⅡ-EDTA稀释浓度分别为0.1mg/L和1.68mg/L作为助剂与嘧肽霉素混合使用后,比单独使用嘧肽霉素作用效果要好,最好锌、铁离子不混合与嘧肽霉素复配。单独施用时,即可以作为微肥促进植物的生长,又可以起到一定的抗病毒的作用,同时,表现为接种前施用铁,接种后施用锌,发病程度较轻,对病毒增殖有较强的抑制作用,并且叶面喷施要好于基部补施,但对于锌、铁离子的抗病作用机理还需要进一步的研究。