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内毒素(Endotoxin, ET)是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分,由结构易变的两性分子即脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)组成,广泛存在于室内空气和一些职业环境中。近五十年来,支气管哮喘发病率迅速上升,已成为各国普遍关注的社会健康问题。现已明确环境因素和遗传因素共同构成其发病因素。流行病学研究表明内毒素能引起哮喘发生和加重,但目前关于内毒素的毒性研究主要集中在其引发的急性肺损伤(ALI)方面,关于阐述内毒素对哮喘疾患作用的研究甚少,讨论其诱发和加重哮喘分子机制的报道更为罕见。此外,作为一种空气环境中普遍存在的毒物,内毒素在生物体内的代谢转化值得引起关注。CYP1A1是属于细胞色素P450超家族的一类同工酶,在生物体内广泛参与内源性和外源性毒物的转化。大量研究表明环境中大多数致癌物都是CYP1A1的底物和诱导物,因此CYP1A1被认为是癌症的一个潜在指征。CYP1A1可受各种因素的影响而改变,如药物、疾病、饮食、激素水平及各种化学物质等,然而关于内毒素对CYP1A1的影响却鲜见报道。为了探讨内毒素对哮喘发生和加重作用的分子机理,为哮喘的预防和治疗提供新的思路,以及研究内毒素对CYP1A1的影响及其分子机制,本实验以LPS腹腔注射染毒技术处理实验动物及卵蛋白(OVA)诱发建立哮喘大鼠模型,以大鼠肺组织为研究材料,选择TNF-α、IL-4、ICAM-1等多种因子为研究重点,采用实时定量PCR、ELISA、荧光分光光度法等方法,从以下三个方面进行研究：(1)探讨0.05mg／kg LPS染毒对哮喘模型大鼠肺组织中TNF-α、IL-4、ICAM-1等哮喘AHR相关因子mRNA或蛋白表达的影响及其分子机制,并对大鼠肺组织进行组织病理学分析；(2)观察不同浓度(0.01、0.1、1mg／kg)LPS染毒对正常大鼠肺组织中上述几种哮喘AHR相关因子mRNA表达的影响及其剂量-效应关系,并对不同剂量染毒组大鼠肺组织进行组织病理学分析；(3)研究不同剂量内毒素暴露对大鼠肺组织CYP1A1mRNA表达及肺微粒体中CYP1A1活性的影响及其作用机制。1.LPS染毒对哮喘大鼠肺组织中TNF-α、IL-4、ICAM-1等哮喘AHR相关因子mRNA或蛋白表达的影响RT-PCR结果表明,LPS单独暴露增加了大鼠肺组织TNF-a、IL-4和ICAM-1 mRNA表达水平,但均没有统计学意义。和对照组相比,OVA可显著诱导大鼠气肺组织中TNF-a、IL-4和ICAM-1mRNA表达升高。LPS和OVA共同作用引起大鼠肺组织中各基因mRNA表达显著升高,较对照组和OVA处理组均有统计学差异。经Elisa法检验,LPS处理组、OVA处理组和OVA+LPS诱导组大鼠肺组织中TNF-a和IL-4蛋白表达水平较对照组均显著升高,且均有统计学差异,其中LPS和OVA共同作用时引起大鼠肺组织中TNF-a和IL-4蛋白表达水平较OVA单独暴露时也有显著增加(##P<0.01和#P<0.05)。2.哮喘模型大鼠肺组织病理学观察和免疫组化分析病理学观察显示,对照组大鼠肺泡结构、肺小血管及毛细血管形态基本正常,极少见炎性细胞浸润,未见明显的病理学变化。LPS处理组、OVA处理组及OVA+LPS诱导组大鼠肺组织较对照组均出现不同程度的病理变化,包括肺泡壁增厚、肺泡腔狭窄、炎性细胞大量浸润,腔内可见脱落的上皮细胞、嗜酸粒细胞和巨噬细胞,肺组织中的平滑肌和基底膜增生等。其中OVA+LPS诱导组大鼠肺组织病理变化较OVA处理组更为显著。3.不同浓度LPS染毒对大鼠肺组织中TNF-α、IL-4、ICAM-1等哮喘AHR相关因子mRNA表达的影响RT-PCR结果显示,不同浓度(0.01、0.1、1mg／kg)LPS对大鼠染毒后,随着LPS染毒剂量的递增,大鼠肺组织中TNF-a、IL-4、ICAM-1mRNA表达水平均依次升高,且在染毒剂量范围内,各基因mRNA的表达水平与LPS染毒剂量之间成正相关,0.1、1mg／kg的LPS染毒可引起三种基因mRNA表达水平较对照组显著升高(有统计学意义)。4.LPS剂量组大鼠肺组织病理学观察和免疫组化分析病理学观察显示,随着LPS染毒剂量的增大,大鼠肺组织的病理学变化愈加明显。0.01、0.1、1mg／kg组大鼠肺组织较对照组均出现不同程度的病理变化(具体特征与哮喘模型大鼠肺组织相似),病理学变化程度为1mg/kg组>0.1mg／kg组>0.01mg／kg组。5.不同浓度内毒素对大鼠肺组织CYP1A1mRNA表达及微粒体中CYP1A1活性的影响结果表明,随着LPS染毒浓度的增大,大鼠肺组织中CYP1A1mRNA表达水平和肺微粒体CYP1A1的活性均依次升高,在染毒范围内(0.01-1mg／kg)二者与LPS染毒浓度之间分别具有良好的剂量-效应关系(r>0),且当染毒浓度为0.1mg／kg和1mg／kg时,肺CYP1A1mRNA表达水平和肺微粒体CYP1A1的活性分别较对照组有显著性差异。总之,在基因表达水平和酶活水平上,内毒素对CYP1A1均产生了明显的诱导作用,且两方面具有高度的一致性。6.结论综上所述,内毒素染毒可以诱导正常和哮喘大鼠肺组织TNF-αIL-4、ICAM-1等哮喘AHR相关基因表达上调,并对大鼠肺组织形态具有重塑作用,从而诱发和加重哮喘疾病。此外,在低剂量范围内,大鼠肺组织中TNF-αIL-4、ICAM-1等哮喘AHR相关基因表达水平和肺组织病理学改变程度均与内毒素染毒浓度具有明显的剂量-效应关系(r>0)。另一方面,内毒素以剂量依赖的方式显著诱导了大鼠肺组织中CYP1A1 mRNA表达和EROD活性,其诱导机制可能与AhR介导型机制相类似,肺组织对外源化合物及药物的代谢可能会因此受到影响,并可以推测内毒素可能具有一定的致癌性。