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目的:在对前期课题组建立的SAGE标签数据库针刺抗哮喘差异表达基因Mt2进行克隆和表达、纯化的基础上,从SD大鼠在体和离体实验两方面对其在哮喘中的作用进行功能验证研究,以期为针刺抗哮喘的效应物质基础研究提供科学依据。
方法:利用大鼠在体呼吸功能检测和离体气管螺旋条张力检测技术,对针刺抗哮喘差异表达基因Mt2重组蛋白在哮喘中的作用进行功能验证研究。
结果:
1.离体实验
1)重组蛋白MT-2各浓度10分钟内舒张大鼠离体气管螺旋条的时效作用:与Ach组比较,MT-2浓度为100、200、400ng/ml实验组气管螺旋条张力值分别在第3-10,2-10,4-10分钟,有显著统计学差异(P<0.05);800ng/ml组气管螺旋条张力值无显著统计学差异。说明MT2浓度为100、200、400ng/ml时具有显著舒张大鼠气管螺旋条的作用。
2)大鼠离体气管螺旋条实验每组张力值量效作用比较:TB、HC、MT-2(100,200,400 ng/ml)与Ach组气管螺旋条张力值比较有显著统计学差异(F=8.856,P<0.01)。说明MT-2对于降低大鼠离体气管螺旋条张力的作用呈剂量依赖关系,且MT-2终浓度为200ng/ml时舒张气管螺旋条的作用最明显。
3)同等浓度的MT-2与S100A9组降低大鼠离体气管螺旋条张力的作用比较:100ng/ml浓度时,大鼠气管螺旋条张力值比较在第2-6分钟有显著统计学差异(P<0.05),MT-2优于S100A9组。浓度为200,400,800ng/ml时各分钟均无显著统计学差异,浓度为200,400ng/ml时,MT-2与S100A9具有同等舒张气管螺旋条的作用。
2.在体实验
1)重组蛋白MT-2降低哮喘大鼠气道阻力的时效曲线图显示:MT-2浓度组1ng/kg、10ng/kg、100ng/kg与AS组大鼠气道阻力比较分别在第3、3、3-5分钟有显著统计学差异(P<0.05),说明MT-2蛋白1、10、100ng/kg浓度组有显著降低哮喘大鼠气道阻力的作用。
2)各组激发后2-4分钟气道阻力之和量效曲线比较结果显示:各组方差不齐,与AS比较,TB,HC,MT-2(1,10,100ng/kg),Trx(1,10ng/kg)组有显著统计学差异(F=18.684,P<0.01)。MT-2蛋白组以浓度为100ng/kg时作用最明显,表明MT-2降低大鼠气道阻力的作用呈剂量依赖关系。
3) MT-2各组与同等浓度的S100A9蛋白组降低哮喘大鼠气道阻力的作用比较:10ng/kg浓度组气道阻力第2-3分钟比较有显著统计学差异(P<0.05),该浓度MT-2效果较优。100ng/kg浓度组各分钟气道阻力比较无统计学差异,说明两者效应无差别。1000ng/kg比较气道阻力在第3-4分钟有显著统计学差异(P<0.05),该浓度S100A9效果较优。
结论:
1.重组蛋白MT-2浓度为100、200、400ng/ml时,对大鼠气管螺旋条均有明显的舒张作用,以200ng/ml的舒张作用最强。
2.在体实验结果表明重组蛋白MT-2浓度为1、10、100ng/kg时可以明显降低哮喘大鼠气道阻力,改善呼吸功能,其中以100ng/kg浓度组作用最明显。
3.重组蛋白MT-2对大鼠气管螺旋条的舒张作用和对哮喘大鼠气道阻力的降低作用,均呈现时间和剂量依赖性。
4.重组蛋白MT-2和S100A9均对大鼠气管螺旋条有明显舒张作用,对哮喘大鼠气道阻力有明显降低作用,表明抗氧化蛋白MT-2、钙结合蛋白S100A9均参与针刺抗哮喘作用的发挥。