背景：近年来,随着器官移植、骨髓移植的广泛开展,艾滋病和肿瘤患者的增多以及皮质类固醇激素、广谱抗生素、免疫抑制剂的大量应用,侵袭性念珠菌感染的发病率明显增高,其对免疫抑制和免疫缺陷病人的危害性大,死亡率高,已成为威胁患者生命最严重的并发症之一。研究表明,尽管白色念珠菌仍是最主要的病原菌,但其在临床分离菌中所占的比例逐年下降,而热带念珠菌等非白色念珠菌感染比例呈上升趋势,且克柔念珠菌对氟康唑天然耐药,光滑念珠菌对此药不敏感,给临床的治疗带来一定的困难。 有资料表明,早期诊断能显著提高念珠菌感染患者的生存率。然而,侵袭性念珠菌感染的临床表现缺乏特异性,不同病原菌之间在毒力、感染部位、药物敏感性以及临床预后等方面均有差异,对其做出诊断常需结合实验室诊断结果。目前侵袭性念珠菌的实验室诊断方法包括培养和表型检测法、血清学检测法、组织病理切片鉴定法与分子生物学鉴定技术等。真菌培养阳性率低,且费时费力；血清学方法应用范围窄,易出现假阳性或假阴性,且无法鉴定到种,无法满足新的诊断需要；组织病理鉴定法为有创性检查,患者较难接受,且对于凝血功能差的重症侵袭性念珠菌感染患者,一般不宜采用。该方法阳性率低。这些限制了其在临床诊断中的运用。因此,急需建立一种快速、特异、敏感的侵袭性念珠菌早期诊断方法,为实施针对性治疗提供依据。 分子生物学方法特异性和敏感性高,并且可快速诊断,是目前念珠菌诊断研究中最活跃的一种方法。荧光定量PCR技术具有自动化程度高、操作过程全封闭、无污染、实时性、能实现多重反应等优点,已广泛用于病毒、细菌等病原体的检测,但目前在国内尚未见到应用该技术鉴定念珠菌的报道。为此,我们期望能借助于现代先进的分子生物学方法建立侵袭性念珠菌早期诊断的快速分子鉴定方法。 目的：根据念珠菌ITS区基因的种间变异性和种内保守性,联合使用真菌通用引物PCR法和多重荧光定量PCR法,建立一种可应用于侵袭性念珠菌早期诊断的快速分子鉴定方法。 方法： 1、1)建立真菌通用引物PCR法；2)用该方法分别扩增13种94株临床上常见的致病性真菌、5种细菌和人全血细胞的DNA,验证其特异性；3)将真菌悬液按10倍倍比稀释为：5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101CFU/ml后提取DNA,用真菌通用引物PCR法进行扩增,验证其敏感性；4)随机抽取10份样品提取DNA,用真菌通用引物PCR法进行4次重复实验,验证其重复性。 2、1)建立多重荧光定量PCR法；2)用该方法分别扩增13种94株临床上常见的致病性真菌、5种细菌和人全血细胞DNA,验证其特异性；3)将真菌悬液按10倍倍比稀释为：5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101CFU/ml后提取DNA,用多重荧光定量PCR法进行扩增,验证其敏感性；4)随机抽取10份样品提取DNA,用多重荧光定量PCR法进行4次重复实验,验证其重复性。 3、真菌通用引物PCR法、多重荧光定量PCR法检测临床标本：取40例怀疑真菌感染患者的痰液标本,提取DNA,分别用真菌通用引物PCR法、多重荧光定量PCR法对其进行检测,并与常规真菌培养法(VITEK 2.0)结果进行对照,探讨该方法的临床应用价值。 结果： 1、本研究建立的真菌通用引物PCR法对13种94株临床上常见的致病性真菌,包括念珠菌属、隐球菌属、曲霉菌属等均扩增出特异条带,对5种细菌和人全血细胞DNA均不扩增。其对白色念珠菌的最低检测浓度为5×102CFU/ml。随机抽取的10份样品,经真菌通用引物PCR法进行4次重复实验,结果均与常规真菌培养结果相符。该方法快速简便,从DNA提取到PCR产物电泳图采集结束在3h内即可完成。 2、本研究建立的针对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌的多重荧光定量PCR法,只与13种94株真菌、5种细菌和人全血细胞DNA中相应的真菌DNA反应,出现"S"型曲线,而对其他真菌、细菌和人全血细胞DNA的反应均为阴性。其对四种念珠菌的最低检测浓度为5×103CFU/ml;随机抽取的10份样品经荧光定量PCR法进行4次重复实验,结果均与常规真菌培养结果相符。该方法快速简便,从DNA提取到获得荧光定量PCR结果在4h内即可完成,适合临床实验室常规使用。 3、在40例临床标本中,有38例真菌通用引物PCR法和培养法的鉴定结果一致,其中阳性30例,阴性8例,两者检测符合率为95％。36例多重荧光定量PCR法与培养法鉴定的结果完全一致,两者检测符合率为90％。统计学分析结果显示真菌通用引物PCR法与传统培养法、多重荧光PCR法与常规培养法的阳性检出率均无显著性差异。 结论： 1、真菌通用引物PCR法快速简便、特异性和敏感性高,重复性好,具有广泛的通用性。该方法不仅是一种快速的侵袭性真菌感染早期诊断方法,也可用于致病真菌菌种鉴定和分型的初筛。 2、多重荧光定量PCR法特异性和敏感性高,重复性好,高效简便,能够在-次试验中鉴定四种不同的念珠菌,适合临床实验室常规使用。 3、联合应用真菌通用引物PCR法、多重荧光定量PCR法检测临床标本,特异性高,快速简便。它将有助于侵袭性念珠菌感染的早期快速诊断,有望成为临床念珠菌常规诊断方法。