第一部分UPEC诱导大鼠睾丸巨噬细胞分泌PK2【目的】探究PK2在UPEC诱导的睾丸炎中,在巨噬细胞上的定位及表达情况。【方法】构建UPEC大鼠睾丸炎模型:将细菌悬液由双侧输精管逆行注射,同时用相同方法注入等体积的生理盐水设置对照组。各组大鼠建模7天后,对睾丸进行UPEC基因Pap C及菌落鉴定以确认建模是否成功。电镜检测UPEC在睾丸中的定位情况。分离睾丸巨噬细胞,对细胞内PK2的表达情况进行定位及定量的分析,同时用ELISA检测间质液及细胞培养上清中PK2的表达水平。【结果】各组大鼠处理7天后,感染组睾丸体积较对照组缩小,质量减轻,组织切片内可见生精小管上皮变薄,间质中大量巨噬细胞浸润,精子数量及前向运动率均降低。Pap C基因在对照组中无表达,但可表达于感染组睾丸中。感染组睾丸间质液涂布于平板,次日可见平板上菌落生长,而对照组间质液涂布的平板上无菌落生长。电镜结果显示,对照组大鼠睾丸间质部充盈着丰富的间质液且巨噬细胞数量较少,而感染组的间质中可见大量巨噬细胞浸润,且可观察到UPEC侵入间质区域。免疫荧光结果显示,在对照组中,PK2主要在巨噬细胞的细胞核内表达,而在感染组中,PK2则弥散于细胞质中。q RT-PCR及Western blot结果显示,感染后巨噬细胞内PK2水平较对照组明显增加,ELISA结果提示巨噬细胞体外培养上清及睾丸间质液中的PK2浓度也随之显著增加。【结论】UPEC可入侵至睾丸间质,促进PK2在巨噬细胞内的表达及向细胞外释放,使其自身所处的外周微环境中也包含高浓度的PK2。第二部分PKR-A抑制UPEC诱导的睾丸炎性损伤【目的】在第一部分中,UPEC诱导睾丸巨噬细胞分泌大量PK2,在此基础上,我们进一步探索,异常高表达的PK2可能对睾丸结构和功能造成的影响。【方法】用第一部分建模方法构建对照组及感染组大鼠模型,次日予以感染后的部分大鼠睾丸原位注射PK2抑制剂PKR-A,余下的感染组大鼠及对照组大鼠睾丸原位注射相同体积的DMSO。7天后观察三组大鼠睾丸切片情况,并对精子总数及前向运动率进行分析。运用免疫化学发光法对各组大鼠血清中的睾酮进行检测。分离三组大鼠睾丸间质内的细胞,运用流式细胞术对巨噬细胞亚型的比例变化情况进行分析。【结果】对照组大鼠的睾丸中可见生精小管管腔内各阶段生精细胞排列整齐,而感染组可见明显炎性损伤,表现为生精上皮变薄且排列紊乱,部分生精细胞出现空泡样改变,睾丸间质中可见大量炎性细胞浸润,PKR-A抑制组大鼠睾丸的炎性损伤有所缓解。感染组大鼠的精子总数和前向运动率均较对照组降低,但PKR-A干预后精子总数和前向运动率有所提升。血清中的睾酮也呈现类似变化。较之对照组,感染组内CD68+-CD163+巨噬细胞亚型比例下降,CD68+-CD163-巨噬细胞比例升高。而干预组较之感染组,CD68+CD163+亚型的巨噬细胞比例升高,CD68+-CD163-巨噬细胞比例降低。【结论】在UPEC诱导的大鼠睾丸炎模型中,异常增高的PK2是造成睾丸炎性损伤的重要因素之一,并且可进一步对精子质量及血清睾酮水平产生负性影响,但在PK2抑制剂干预后,这种炎性损伤可以在一定程度上得到缓解。第三部分PK2通过促进NLRP3通路活化促进IL-1β的分泌【目的】探索PK2如何促进睾丸炎性损伤及其相关调控机制。【方法】本研究分为体内和体外实验。在体内实验中,按照第二部分的处理方式将大鼠分为三组。建模7天后,取各组大鼠的睾丸间质液,运用ELISA检测IL-1β的浓度,运用caspase-1活性检测试剂盒检测各组大鼠巨噬细胞内caspase-1的活性。分离大鼠睾丸巨噬细胞后,运用Western blot对细胞上清和细胞进行NLRP3通路相关蛋白的检测。在体外实验中,分离出正常大鼠睾丸巨噬细胞,给予或不给予LPS预处理后,在细胞培养基中加入UPEC进行体外刺激,并同时给予不同剂量的PK2重组蛋白进行共培养。最后,在细胞实验原有的分组基础上,分别添加NLRP3的抑制剂MCC950或caspase-1的抑制剂VX-765进行干预。体外实验部分的检测指标及方法同体内实验。【结果】大鼠处理7天后,ELISA结果显示,正常大鼠的睾丸间质液中无法检测到IL-1β,而在感染组中,间质液中的IL-1β显著升高,而经过PKR-A抑制剂干预后,IL-1β的水平下降。正常睾丸巨噬细胞中的caspase-1活性维持在较低水平,而在感染组中,细胞中的caspase-1活性显著增加,PKR-A可以抑制活性增加的水平。正常大鼠的巨噬细胞上清中无法检测到cleaved caspase-1和cleaved IL-1β,而这些具有活性的蛋白存在于感染组和PKR-A干预组的细胞上清中;细胞中cleaved caspase-1和cleaved IL-1β的表达趋势与上清相符。感染组细胞中的pro-IL-1β绝大部分被切割成为有活性的cleaved IL-1β,而PKR-A干预组中的pro-IL-1β仍大量存在。体外实验中,UPEC刺激正常大鼠睾丸巨噬细胞分泌IL-1β,加入不同浓度的外源性PK2,可以进一步促进IL-1β分泌,且分泌量与PK2的浓度正相关。加入不同浓度的外源性PK2,可以提高巨噬细胞内caspase-1的活性。UPEC可诱导正常大鼠睾丸巨噬细胞高表达NLRP3,并促进其向细胞外释放cleaved caspase-1,加入PK2后可进一步加强这一趋势。加入NLRP3和caspase-1的抑制剂,可以抑制巨噬细胞中caspase-1活性,并抑制巨噬细胞向上清分泌cleaved caspase-1和cleaved IL-1β。【结论】UPEC通过激活NLRP3炎性小体通路促进睾丸巨噬细胞分泌IL-1β,而UPEC诱导上调的PK2进一步促进了这一病理过程。第四部分睾丸巨噬细胞释放IL-1β抑制睾酮合成【目的】探究睾丸巨噬细胞分泌过量IL-1β对间质细胞合成睾酮的影响。【方法】以重组IL-1β作为阳性对照,在原代间质细胞的培养基内加入不同浓度的IL-1β共培养24小时后,用CCK8试剂盒检测细胞活性,用化学免疫发光法检测培养上清的睾酮水平,同时q RT-PCR检测细胞内与睾酮合成相关的酶St AR、P450scc、3β-HSD、P450c17和17β-HSD的表达水平。此外,收集第三部分不同处理后的巨噬细胞培养上清(在PK2干预组中另加入抗IL-1β抗体)与间质细胞共培养24小时后,对细胞活性、上清睾酮水平以及睾酮合成相关酶的基因表达情况进行检测。【结果】不同浓度的IL-1β与间质细胞共培养后,对细胞活性无显著影响,但可抑制睾酮合成水平。间质细胞中睾酮合成相关酶St AR表达水平增高,P450scc和P450c17表达水平下降,3β-HSD和17β-HSD表达水平未见明显差异。第三部分经处理的巨噬细胞上清与间质细胞共培养后,对细胞活性无显著影响,亦可抑制睾酮合成相关酶P450scc和P450c17的m RNA表达从而抑制睾酮水平,而在培养中加入IL-1β中和性抗体可以拮抗此抑制作用。【结论】PK2促进被UPEC活化的睾丸巨噬细胞释放大量IL-1β,睾丸间质微环境中IL-1β的浓度升高可抑制睾酮合成相关的酶P450scc和P450c17的表达,从而降低睾酮水平,而St AR基因的表达水平升高提示间质细胞可能出现一过性的合成代偿反应。