目的新型四氢嘧啶类化合物ZL-5015(1,3-二环戊基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-、甲酸二乙酯)兼具抗炎和免疫抑制活性,本研究采用体内和体外实验模型探讨ZL-5015的免疫抑制作用特点及作用机制,为后续的结构改造及深入的作用机制研究提供参考信息。研究内容1.ZL-5015对正常小鼠免疫功能的影响1.1对体液免疫功能的影响---兔红细胞免疫小鼠产生血清溶血素(IgM)模型1.1.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,各组动物均连续7天给药,给药后第2天上午,每只鼠腹腔注射20%(V/V)的兔红细胞生理盐水0.2ml进行免疫,同日下午继续给药,免疫后第6天(免疫当天为第0天),动物摘眼球取血,分光光度法检测各组小鼠血清中的溶血素水平。1.1.2结果ZL-5015高、中剂量组(200.100mg/kg.b.w)能明显抑制小鼠血清溶血素水平,抑制率分别为32.8%和20.0%(P=0.000,P=0.000),ZL-5015低剂量组(50mg/kg.b.w)能轻微抑制小鼠血清溶血素水平,但与溶媒对照组比较差异无统计学意义(P=0.131)。1.2对细胞免疫功能的影响---二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型1.2.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,给药第一天用1%DNFB致敏小鼠,连续给药7天,于致敏后第7天,取1%DNFB丙酮-橄榄油(1：1)20gL均匀涂布于每只小鼠右耳的两面进行攻击。于攻击24h后,给小鼠称重,颈椎脱臼处死,剪下左右耳廓,以左右耳片质量差值作为肿胀度,并计算肿胀率。取出脾脏和胸腺称重并计算相应的器官指数。1.2.2结果ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg.b.w)与模型组比较,均能显著抑制二硝基氟苯诱导的小鼠耳廓肿胀(P=0.000,P=0.000,P=0.015),抑制率分别为：56.45%、47.58%、29.84%。ZL-5015高剂量(200mg/kg.b.w)能抑制小鼠的脾脏指数(P=0.013),中、低剂量组(100、50mg/kg.b.w)无抑制作用(P=0.482,P=0.418)。ZL-5015高、中、低剂量组(200、100.50mg/kg.b.w)对小鼠的胸腺指数无显著影响(P=0.384,P=0.527,P=0.570)。1.3ZL-5015对网状内皮细胞(巨噬细胞)吞噬功能的影响(碳粒廓清实验)1.3.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,连续给药7天。末次给药1h后,先称小鼠体重,每只小鼠尾静脉均注射印度墨汁(用生理盐水稀释6倍),按0.1ml/10g注射。分别于注射后于1min(t1)和10min(t10)小鼠眼球取血,检测OD450值,最后将小鼠颈椎脱臼处死,同时摘取小鼠肝脏、脾脏,并称湿重,计算廓清指数(K)及吞噬指数(A)。1.3.2结果化合物ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg.b.w)对小鼠吞噬指数A无明显影响(P=1.000,P=0.999,P=1.000)。2.ZL-5015对大鼠佐剂性关节炎模型的影响2.1ZL-5015对大鼠佐剂性关节炎模型关节炎指数、足趾肿胀度、体重的影响2.1.1材料与方法雌性SD大鼠48只,随机分为6组,每只鼠左后足趾皮内注射100μL弗氏佐剂,致炎后第16天开始给药和测量,共给药12天。采用排水法测足部体积：在大鼠足部踝骨关节突出部位划一条线作为标记,用足趾肿胀仪测量,间隔4天测一次足趾肿胀情况及体重。SD大鼠免疫后,根据大鼠四肢关节炎症的红、肿及硬化程度,计算多发性关节炎指数。2.1.2结果致炎后第20天,ZL-5015高剂量(200mg/kg.b.w)处理组关节炎指数与模型组比较明显下降,下降率为20.0%(P=0.010),说明此时高剂量药物开始起效。对足趾肿胀及体重无显著影响。致炎后第24天,ZL-5015高、中、低剂量(200、100、50mg/kg.b.w)使关节炎指数分别下降34.5%、25.0%、19.0%(P=0.000,P=0.001,P=0.010)。高剂量能使足趾肿胀度下降49.5%(P=0.048),中、低剂量使足趾肿胀度分别下降40.4%及21.5%,但无统计学意义(P=0.194,P=0.845)。对体重有增重趋势,但差异无统计学意义。致炎后第28天,ZL-5015高、中、低剂量(200、100、50mg/kg.b.w)使关节炎指数分别下降43.0%、36.7%、26.6(P=0.000,P=0.000,P=0.001)。高、中剂量使足趾肿胀分别下降54.0%及48.7%(P=0.034,P=0.041),低剂量下降39.4%,但差异无统计学意义(P=0.150)。对体重有增重趋势,但差异无统计学意义。2.2ZL-5015对弗氏佐剂关节炎大鼠血清促炎细胞因子的影响2.2.1材料与方法于佐剂关节炎造模第28天,股动脉取血,3000rpm离心10min,取上清,ELISA方法检测IL-1β及TNF-α活性2.2.2结果ZL-5015高、中剂量(200、100mg/kg)与模型组比较,均可显著降低关节炎大鼠血清IL-1β的水平(P=0.006,P=0.049),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为：27.0%,19.1%；ZL-5015低剂量组(50mg/kg)可以轻微降低大鼠血清IL-1β的水平(P=0.426)。ZL-5015高、中剂量组(200、100mg/kg)均可以显著降低大鼠血清TNF-a的水平(P=0.000,P=0.005),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为：29.2%,21.6%；ZL-5015低剂量组(50mg/kg可以轻微降低大鼠血清TNF-α的水平,但差异无统计学意义(P=0.173)。2.3ZL-5015对关节炎部位促炎细胞因子的影响2.3.1材料与方法于造模第28天,大鼠断头处死,在非致炎侧踝关节上方0.5cm处摘取肿胀的足爪,剪碎,生理盐水浸泡过夜,离心取上清,ELISA方法检测IL-1β及TNF-a活性。2.3.2结果ZL-5015高、中剂量(200、100mg/kg)与模型组比较,均可显著减少关节炎部位IL-1β的含量(P=0.000,P=0.019),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为：30.3%,19.3%；ZL-5015低剂量(50mg/kg)可以轻微减少炎症部位IL-1β的含量,但差异无统计学意义(P=0.123)。ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg)均可显著减少炎症部位TNF-α的含量(P=0.000,P=0.004,P=0.039),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为：31.9%,22.0%和15.2%。3.ZL-5015对淋巴细胞功能的影响3.1ZL-5015对Con A和LPS诱导小鼠脾细胞增殖反应的影响3.1.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)和LPS(10μg/ml)刺激小鼠脾细胞增殖作为体外免疫模型,检测给药48小时后各组细胞的代谢活力。3.1.2结果ZL-5015高、中、低剂量均可以显著抑制Con A诱导的小鼠脾细胞增殖反应,(P=0.000,P=0.000,P=0.000),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：33.10%、21.0%和13.28%。ZL-5015高、中剂量组均可以显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应(P=0.000,P=0.000),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：25.90%、14.95%,ZL-5015低剂量组有轻微抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应的趋势,但差异无统计学意义(P=0.087)。3.2ZL-5015对混合淋巴细胞培养反应的影响3.2.1材料与方法将BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠的脾细胞分别制成悬液,按照1：1混合制成细胞浓度为6x106个/mL的细胞悬液,按分组加入药物,用96孔培养板培养72h后各组细胞的代谢活力。3.2.2结果ZL-5015高、中、低剂量组均可以显著抑制混合淋巴细胞的增殖反应(P=0.000,P=0.000,P=0.037),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：37.2%、17.4%和5.0%。3.3ZL-5015对Con A刺激小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ的影响3.3.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)刺激小鼠脾细胞活化,检测给药48小时后各组细胞中上清液白细胞介素2和干扰素γ的含量。3.3.2结果ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可显著抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌白介素2(P=0.000,P=0.000,P=0.007),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：29.37%、20.31%和11.35%。ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可以显著抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌干扰素γ(P=0.000,P=0.002,P=0.030),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：31.9%、23.6%和15.9%。3.4ZL-5015对小鼠脾细胞细胞因子mRNA表达的抑制作用3.4.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)刺激小鼠脾细胞活化,使用荧光定量PCR检测给药48小时后各组细胞中白细胞介素2和干扰素γmRNA表达的变化。3.4.2结果ZL-5015(40.20.10μM)可抑制由Con A诱导的IL-2mRNA的表达(P=0.010,P=0.024,P=0.048)。ZL-5015(40、20、10μM)可抑制由Con A诱导的INF-γmRNA的表达(P=0.005,P=0.013,P=0.043)。3.5ZL-5015对LPS刺激小鼠脾细胞分泌IgG1和IgG2a的影响3.5.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,LPS(10μg/ml)激小鼠脾细胞活化,各组给药作用48小时后,收集培养上清液检测IgGl和IgG2a的含量。3.5.2结果ZL-5015高、中剂量组(40、20μM)均可以显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl,(P=0.000,P=0.001),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：27.8%、18.0%；ZL-5015低剂量组(10μM)可以轻微抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl,但差异无统计学意义(P=0.105)。ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可以显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgG2a(P=0.000,P=0.000,P=0.011),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：31.6%、22.7%和13.7%。3.6ZL-5015对T细胞亚类的影响3.6.1材料与方法脾细胞制备、实验分组及给药均同3.5.1所述,48小时后收集细胞,用荧光标记的抗小鼠CD3、CD4、 CD8抗体染色,流式细胞仪检测。统计方法3.6.2结果ZL-5015主要降低Con A诱导的CD4弱表达和CD3弱表达T细胞亚群(CD4LowCD3Low)的比例。统计学处理应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。T细胞亚类占细胞总数的比例以百分数表示,先采用RxC表资料的卡方检验对各组细胞的百分率差异进行多组间的总体检验,然后采用四格表资料的卡方检验进行组间细胞百分率的两两比较。定量数据结果以均数±标准差表示,采用单向方差分析法分析,先进行方差齐性检验,若方差齐用LSD方法多重比较；若方差不齐,采用Welch F检验和Dunnett’s T3法多重比较。显著性水准取α=0.05,以P<0.05时,组间差异具有统计学意义。结论1、ZL-5015可降低兔红细胞诱导小鼠产生血清溶血素的活性,降低二硝基氟苯诱导的小鼠耳廓的肿胀度,对小鼠碳粒廓清的速率无明显影响,提示对小鼠的体液免疫及细胞免疫功能有抑制作用,对非特异性免疫功能无影响。2、ZL-5015可以减轻弗氏佐剂关节炎模型的关节炎指数,足趾肿胀,提示对类风湿关节炎具有一定的临床应用前景。3、ZL-5015可以减少弗氏佐剂关节炎模型血清及炎症部位中的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的含量,提示对佐剂性关节炎的治疗作用与抑制促炎细胞因子的产生与关。4、ZL-5015可抑制Con A和LPS诱导的小鼠脾细胞的增殖反应,提示对T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应有直接的抑制作用。5、ZL-5015可以显著抑制混合淋巴细胞的增殖反应(代谢活力),提示对特异抗原诱导的淋巴细胞增殖反应有直接的抑制作用。6、ZL-5015可以显著抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ,提示其免疫抑制作用与抑制细胞因子的产生与分泌有关。7、ZL-5015可抑制由Con A诱导的IL-2及INF-y mRNA的表达,提示其抑制细胞因子产生的作用环节在mRNA表达水平。8、ZL-5015可以显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl和IgG2a,提示其可直接作用于B淋巴细胞而抑制抗体的产生。9、ZL-5015可降低Con A诱导的CD4弱表达和CD3弱表达T细胞亚群(CD4LowCD3Low)的比例,提示其作用机制可能是抑制CD4+CD3+细胞的活化与增殖,从而抑制免疫反应。10、总之,ZL-5015对体液和细胞免疫反应均有抑制作用,对T和B淋巴细胞的增殖与分泌功能具有直接抑制作用,对自身免疫性疾病动物模型有效,但需要高剂量(100mg/kg以上),与现有临床药物相比其作用强度还不够理想,需要进一步结构改造。