NF-κB是一种序列特异性DNA结合转录因子。在未激活状态下,NF-κB与其抑制蛋白IκB结合滞留在细胞质中。当细胞受到刺激,如病毒感染、紫外线照射、细胞因子(TNFα等)作用下,通过细胞内的NF-κB信号传导通路,抑制蛋白IκB降解,NF-κB进入细胞核,与核内DNA靶点结合,控制其众多靶基因的表达,从而参与细胞生长、分裂、凋亡、更新、炎症、癌变等生理及病理过程。NF-κB在炎症和癌症中被广泛激活,因此一度成为药物筛选和疾病治疗的重要靶点,如各种NF-κB抑制剂的开发。但由于NF-κB所具有的双刃剑作用,传统NF-κB抑制剂因其显著的副作用而始终未成为临床药物。因此,基于NF-κB的生物医学应用价值的探索需要新的研究策略。本研究发展了三种基于NF-κB的新型基因表达控制技术,并探索了其生物医学应用价值。1.基于NF-κB的高活性真核启动子研制及其应用研究人巨细胞病毒(hCMV)主要早期启动子(MIEP)是目前生命科学基础研究和各类基因工程、基因治疗、基因编辑中广泛使用的活性最高的真核启动子。本研究用指数富集(SELEX)系统筛选获得的高亲和力人工序列替换人MIEP中的天然NF-κB结合位点(κBs),构建了各种突变型的MIEP(mMIEP)。通过多种转录活性评价系统的检测,本研究成功筛选出了3个转录活性显著高于野生型MIEP的mMIEP。这些mMIEP作为人工启动子可以广泛用于基因工程药物生产及基因治疗领域。此外,本研究为启动子工程提供了一个快速构建和筛选各种活性启动子的新方法,并且制备了一系列具有多种转录活性的mMIEPs,可用于未来合成生物学中目的基因表达水平的灵活控制。本研究将改造的人工启动子应用于hG-CSF蛋白的分泌表达,针对该蛋白的表达研究不仅可以深入的验证启动子表达效率,还为mMIEP启动子在基因工程制药的应用提供了重要依据。2.新型NF-κB活性抑制基因载体的构建及其应用研究已有研究证明,NF-κB通过调控其靶基因,在肿瘤细胞增殖、血管生成和侵袭转移等过程中起重要作用。而且很多研究表明,NF-κB家族蛋白在肿瘤组织细胞中的表达量比在正常组织细胞中有明显的增强。NF-κB已经成为新型药物治疗和研发的重要靶点。因此,研究人员开发了很多不同的NF-κB抑制剂,但由于NF-κB不仅是疾病相关的转录因子,它在细胞的正常生理功能中也发挥重要作用,对其进行过强的抑制会产生严重的副作用,这些抑制剂很难成为商品化的临床药物。为了克服这一局限性,本研究中将经典的NF-κB特异诱骗子(decoy)序列作为一种NF-κB特异性启动子元件,与最小启动子序列融合,构建了一种NF-κB调控启动子(decoy minimal promoter,DMP)。本研究以此启动子构建了一种新型NF-κB活性控制基因载体,该载体能够在DMP启动子的控制下表达靶向于NF-κB RelA的人工miRNA。本研究证实,这种载体可以对细胞内NF-κB活性进行感知和调控。载体在细胞内的表达可以形成一个完美的反馈循环,实现NF-κB的自我调控。将载体转染到细胞内后,NF-κB的活性越高,DMP启动子的转录活性也就越高,amiRNA的表达量也就越高。DMP-amiRNA系统能够适度的抑制NF-κB过度活化细胞(如肿瘤细胞)内的NF-κB活性,引起肿瘤细胞的凋亡,但对正常细胞的不产生显著影响。本研究通过筛选,获得一种效果良好的新型NF-κB活性抑制剂——DMP-amiR533。本研究不仅发展了一种抑制NF-κB活性的新策略,所筛选获得的DMP-amiR533在治疗炎症和癌症等NF-κB过度活化疾病中具有重要应用价值。3.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因表达载体构建及其应用研究近年来,免疫疗法对癌症治疗有很大贡献,但是,肿瘤细胞特异性抗原仍然是目前癌症免疫疗法最关键的限制因素。因此,研究人员正在通过肿瘤测序和生物信息学预测等方法寻找新抗原来开发个性化癌症免疫疗法,但该策略技术复杂性高、成本高、周期长。本研究通过开发肿瘤细胞特异性基因表达技术,构建了一种癌症的新型免疫疗法,该技术使用NF-κB特异性基因表达载体在肿瘤细胞表面表达特定的蛋白质或多肽,这些蛋白质或多肽可以作为人造新抗原起作用,用于区分肿瘤细胞和正常细胞并刺激免疫系统杀死肿瘤细胞。本研究构建并验证了NF-κB活化基因表达(NF-κB-activating gene expression,Nage)载体系统,该载体利用DMP启动子,使载体携带的下游效应基因可以在各种肿瘤细胞表面特异性表达某种蛋白质或多肽,如HBsAg、CRT和SBP。本研究将Nage载体包装在腺相关病毒(AAV)中,作为肿瘤免疫治疗的病毒载体药物,最终结果显示,重组AAV可以显著抑制体内肿瘤的生长,并且在实验鼠上未观察到毒副作用。本研究中提出的新型癌症基因免疫疗法在癌症治疗领域具有重要应用价值。总之,本研究发展了基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术,获得了转录活性显著提高的新型启动子(mMIEP)、新型NF-κB活性控制载体(DMP-amiR533),以及NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因表达载体(Nage);这些基于NF-κB的新型基因表达控制技术在生物制药及基因治疗领域具有重要应用价值。