水产养殖业是支撑我国国民经济的一个重要支柱,近些年来得到飞速发展。目前我国的水产养殖总产量已居世界首位。水产养殖业给我国带来了巨大的经济效益,从一定程度上缓解了粮食压力。从长远来看,大力发展水产养殖业不仅是我国今后努力的方向,也是对全球意义重大的战略性决策。然而随着近些年来水产养殖的方式逐渐由粗放式向集约式转化,水产动物病害日趋严重,其造成的损失也处于上升趋势,各种抗生素的使用更加速了抗药性病原菌的富集,给水产养殖病害防治带来了巨大的困难。本研究从基因功能的角度对危害水产养殖的两大病原菌——哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)进行了初步研究。前期的研究已经证实哈维氏弧菌对鲑鱼的致病性与其分泌的胞外产物中的溶血素相关。致病力最强的菌株VIB 645有2个碱基序列非常相似的溶血素基因—vhhA和vhhB,而其它的菌株仅有1个溶血素基因或无此基因。vhhA和vhhB分别位于染色体DNA和一个大小约为65.6 kb的质粒上(命名为pVH1)。这2个基因的碱基序列非常相似(相似度98.8%),其预测编码的氨基酸序列完全相同,并与副溶血弧菌的TLH溶血素的氨基酸序列有高度的相似性(相似性85.6%)。本研究用碱裂解法提取该菌株的毒性相关质粒pVH1,利用多种限制性内切酶(BglII,Hind III,MboI,SacI,NcoI和PstI)进行酶切,以pUC19c质粒为载体构建随机DNA文库并测序。共获得28个克隆片断,合计测序97.63kb,约覆盖质粒1.483倍。采用ORF-finder软件对数据进行分析,共鉴定出125个ORF(大于150 bp),其中79个ORF与数据库中已知基因具有较高同源性,37个ORF具有部分同源性,另有9个ORF在数据库中未找到相似序列,认为是潜在的新基因。所有预测的ORF,根据其功能主要分为以下几类:(1)毒力相关基因,包括RTX(repeats in toxin)毒素钙离子结合蛋白基因,转铁蛋白结合蛋白A前体蛋白基因和外膜粘附蛋白PilT菌毛基因。三者分别参与RTX毒素与钙离子的结合,致病菌的摄铁系统和致病菌在体内的定殖;(2)结合转运相关基因,包括TraC、-D、-F、-G、-H、-I、-K、-N、-U、-W、TrbB、-C,细菌的生存能力或者毒力可通过接合作用得到增强;(3)转座相关基因;(4)其他功能基因,如甲基转移酶、DNA结合蛋白、亚硝酸盐挤压蛋白、运甲状腺素蛋白、脂蛋白、肽酶、DNA复制蛋白等与细菌正常生长代谢相关的基因;(5)未知基因。大部分的基因属于假定蛋白,功能未知。所测得的基因序列大多与创伤弧菌CECT4999携带的毒性质粒pR99、创伤弧菌CECT4602携带的接合质粒pC4602-2以及创伤弧菌YJ016携带的质粒pYJ016有着较高的同源性。目前对迟缓爱德华氏菌致病机理的研究尚缺乏详尽清晰的阐述,很多毒力基因还有待发现。本实验选取了迟缓爱德华氏菌标准菌株EIB 202基因组上一个编码磷脂酶D超级家族蛋白的基因即PLD基因进行了初步研究。该基因全长1245 bp,编码414个氨基酸,从预测的基因编码的氨基酸序列上看,该蛋白具有磷脂酶D超级家族共有的两个HKD保守区,分别位于第137-161位氨基酸和第344-368位氨基酸处。本研究采用自杀质粒pRE118介导的同源重组技术,构建与PLD基因同源的缺失片段,将其导入并整合到野生菌株中的染色体上,再利用筛选压力选出由于同源重组而发生PLD基因缺失的突变株,然后对突变株的致病性及表型做了初步研究。结果表明磷脂酶D超级家族蛋白对迟缓爱德华氏菌致病作用的影响并不明显,突变株与野生株对斑马鱼的半致死量(LD50)分别为2.48×104cfu/fish和2.06×104cfu/fish。对其进行各项表型生理生化指标的测定,结果也显示与野生株无明显差异。该蛋白的具体功能还有待于进一步的体外过量表达确定。