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食源性致病微生物作为食源性疾病的主要诱因,严重威胁全世界的公共卫生安全,因此必须建立健全科学、准确、全面、快速的食源性致病菌检测体系,以保障食品安全,预防和控制食源性致病菌中毒事件发生。本文主要从常见食源性致病菌代谢小分子物质出发,研究其胞内外代谢轮廓,并在此基础上建立常见食源性致病菌代谢指纹图谱,寻找各菌株之间特征性代谢产物,并通过聚类分析和主成分分析各菌株之间差异性和相似性,为研发快速检测方法和建立食源性致病菌代谢产物数据库奠定基础。本论文的主要内容和研究结果如下: 1、通过优化常见食源性致病菌胞内代谢产物前处理方法,得到最佳的提取方法为-40℃6∶3∶1 CH3OH/CH2Cl2/H2O超声辅助提取。通过NIST11数据库检索,总共获得219种胞内代谢产物信息,胞外代谢足迹分析24 h/48 h发酵液共获得175/160种代谢产物信息。其中可作为各菌株之间潜在的生物标志物有:阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)特有的2-氨基苯并恶唑、2-氨基脂肪酸、甘露醇磷酸酯、5-羟基-L-戊氨酸、顺丁二烯酸、十六烷酸甲酯、反式-4-羟基-环己基甲酸、2-羟基己酸、5-羟基吲哚-3-丙酸、3-羟基肉豆蔻酸、9-十七烯酸和9,9-Dimethoxybicyclo[3.3.1]nona-2,4-dione;宋内氏志贺菌(Shigella sonnei)特有的2-甲基-1,2-丙二醇、甘露糖酸内酯和α,羟基苯乙酸;小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)特有的1,5-脱水山梨醇和3-乙基-2,3-二甲基二氢吲哚;铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)特有的甲基甘露糖、Cyclopropane-1-carboxamide,2-butyl-N-(5,6,7,8-tetrahydro-7,7-dimethyl-5-oxoquinazolin-2-yl)-、1-羟基-2-甲基蒽醌和2,5-二叔丁基苯酚;伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)特有的D-松醇;蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus, Bc)特有的磷酸-D-甘露糖苷、1,2-丙二醇磷酸酯、茚并[2',1'∶4,5]噻吩酮[3,2-b]噻喃、4-Chloro-2-nitrobenzyl alcohol、4-氨基苯乙酸、2-甲基-3-氨基丙酸和6-Azaestra-1,3,5(10),6,8-penta en-17-one;金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)特有的D邛可拉伯己糖-2-脱氧-6-磷酸苷、D-赤氏呋喃戊糖-2-脱氧-磷酸苷、甲基丙二酸、3-氨基丁酸、1,3,6-Trimethyl-5-[3-(2-acetylamino-2-methoxycarbonylethyl)-1H-indol-2-yl]-1,3-dihydropyrimidin-2,4-dione、2-甲基-1,2-丁二醇、反式-3-己二烯酸和3-溴-4,5-二羟基-苯乙腈;副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)特有的1,2-二羟基环己烯、3-羟基丙酸、1,13-二羟基十三烷和(R*,S*)-3,4-二羟基丁酸;粪链球菌(streptococcus faecium)特有的phosphonic acid,[(carbonothioylhydrazino)methyl]、2-羟基己酸、1,3-间苯二甲酸、反式巴豆醇、3-甲基-2-羟基戊酸和4-甲基-戊酸-2-酮;大肠杆菌(Escherichia Coli)特有的1,4-丁二醇、β-D-半乳糖、环戊醇和丁醇。结合聚类分析和主成分分析,发现可以将以上11株常见食源性致病菌分为4大类群。主成分分析结果与聚类分析类似,且同类群细菌可以明显区分。 2、通过优化芽孢杆菌(Bacillus)代谢组学前处理方法,获得最佳的提取方法为低温淬灭和使用萃取剂2/2/1 CHsOH/CH2Cl2/H2O。对蜡样芽孢杆菌群菌种进行胞内代谢轮廓分析共得到93种代谢产物信息,并发现其中16种为潜在的生物标志物。通过L-脯氨酸代谢途径分析,苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)可能只通过脯氨酰-4-羟化酶和氨基酸氧化酶等代谢脯氨酸;蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides,Bm)存在脯氨酸脱氢酶和脯氨酰-4-羟化酶,但可能缺少D-氨基酸氧化酶和吡咯啉-4-羟基-2-羧酸脱羟酶;而Bc可以同时通过上述两条代谢途径代谢脯氨酸。此外,Bm中缺乏长链脂肪酸,Bc中缺少醇胺类代谢产物。通过热图分析可以发现各蜡样芽孢杆菌及其类似菌株之间代谢谱图信息存在较大差异。聚类分析和主成分分析表明,聚类分析可将实验菌株分为Bt、Bc和Bm三大类,同时主成分分析能将3种芽孢杆菌明显区分。 3、通过对蜡样芽孢杆菌群菌种产生芽孢前后胞外代谢轮廓分析共得到141种代谢产物信息,且发现形成芽孢前后主要差异为营养物质较少,部分次生代谢产物增加,但并未找到芽孢杆菌形成芽孢前后生物标志性物质。结合形成芽孢前后芽孢杆菌代谢轮廓,发现菌株之间可能存在11种潜在的生物标志物。对芽孢杆菌生成芽孢前后胞外代谢轮廓进行聚类分析很难进行聚类区分,但通过对各芽孢杆菌特征性次生代谢产物进行聚类分析可以明显将上述芽孢菌株分为2个类群,分别为Bc、Bt和Bm,且Bc和Bt再分为两个亚群。 综上所述,本论文优化了食源性致病菌代谢组学前处理方法,并研究了其代谢轮廓,发现了部分潜在的生物标志物,为食源性致病菌代谢产物数据库建立提供了方法学参考和数据支持,也为快速检测技术的研发提供实验基础和理论依据。