牡丹离体再生系统优化与遗传转化体系建立

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牡丹(Paeonia Sufruticosa)市场前景广阔,然而,牡丹的种苗繁殖无法满足当前世界花卉、医药大市场对成品牡丹苗木的需求。为了尽快解决牡丹种苗快速工厂化生产和加快新品种培育进程这两大难题,开展牡丹的离体再生与遗传转化研究是具有重大意义的。本研究以牡丹品种’凤丹’为材料,建立并优化了牡丹成熟胚、幼胚、愈伤组织、子叶节、子叶片、土芽离体再生系统,并初步建立了牡丹子叶节遗传转化体系。在离体再生阶段分别研究了不同外植体、消毒方法、不同激素浓度及其配比对不定芽诱导、不定茅伸长及生根等离体再生过程的影响。结果发现:1、不同外植体的最佳不定芽诱导培养基分别为WPM+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA(成熟胚)、WPM+0.4 mg/L 6-BA+2 mg/L GA3(幼胚)、WPM+3 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 肌醇(愈伤组织)、WPM+0.3 mg/L 6-BA+2 mg/LGA3(子叶节)、WPM+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/LNAA(子叶片)、WPM+1mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA(土芽);2、最佳的不定芽伸长培养基为:WPM+0.3 mg/L 6-BA+1.5 mg/L GA3,伸长率为81.12%,芽的均伸长长度可达1.93 cm;3、采用嫁接法生根效果最佳,移栽后存活率可达66.54%。以牡丹子叶节为受体材料,研究了农杆菌菌株类型、乙酰丁香酮浓度、菌液浓度和侵染时间、共培养时间、pH值、温度对牡丹遗传转化体系的影响。初步建立了牡丹子叶节遗传转化体系。结果发现:选择EHA105(农杆碱型)作为外源基因导入的工程菌比较合适;适宜的乙酰丁香酮(AS)浓度(200μmol/L)、菌液浓度(OD600为0.8)、侵染时间(30min)、共培养时间(3 d)、共培养培养基pH值(5.4)、共培养温度(22℃)均能有效提高牡丹子叶节遗传转化系统的瞬时表达频率。应用该转化体系成功获得牡丹的转基因抗性苗,转化效率约为1.33%。
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