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玉米螟(Ostrinia nubilalis)和大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella Matsumura)等鳞翅目昆虫对农作物生长发育产生严重的影响,是造成农作物产量降低重要因素之一。利用基因工程技术将抗虫基因转入植物体中,培育具有抗虫性状品种,是解决虫害问题的有效途径之一。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在形成芽孢的同时能产生对鳞翅目、鞘翅目等害虫具有毒性的晶体蛋白,这些蛋白杀虫活性高、专一强,被广泛应用到害虫的综合防治上,但随着推广面积逐步扩大,在其持续选择压力下,害虫对这些活性蛋白产生抗性,导致转入外源基因的植物抗虫能力变弱。因此本研究运用易错PCR技术随机向Cry1Ab13类基因的碱基序列中引入突变,构建突变体文库,并将突变基因构建异源重组表达载体,体外诱导表达,将异源表达的蛋白进行抗虫性验证,从而鉴定诱变后基因杀虫效果,并筛选出杀虫活性更好的抗虫基因,为利用Cry类Bt基因提高作物抗虫性,丰富基因资源。本试验主要获得的结果如下:1.易错PCR诱变及构建突变文库。通过易错PCR技术诱变Cry1Ab13基因,通过筛选获得3个突变子。将突变子与pMD18T Vector相连接并转化到E.coli DH5α中,涂布于LB固体平板上,组成突变体库。通过对测序结果进行比对,突变后基因与Cry1Ab13基因碱基序列一致性分别达97.79%、97.93%、98.32%,与Cry1Ab13基因编码的氨基酸序列一致性分别达96.97%、97.12%、97.68。2.致敏性分析。结果表明3个突变基因与已知过敏原序列同源性均小于35%不存在致敏性。3.构建3个原核重组表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。利用无缝克隆技术成功构建了3个异源重组表达载体分别为pET28a-Cry1Ab13-1、pET28a-Cry1Ab13-2、pET28a-Cry1Ab13-3。把构建好的重组表达载体转化到E.coli BL21中,成功构建工程菌株E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13-1)、E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13-2)、E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13-3)。使用IPTG分别进行诱导表达后SDS-PAGE电泳分析表明,工程菌株E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13-1),和未突变基因对照E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13)在79.5KDa左右分别可以表达出特异的条带,与预期大小相符,表明该菌株得到正确的表达。4.室内杀虫活性的生物鉴定:小菜蛾幼虫室内杀虫活性的生物鉴定结果表明24h、48h、72h实验组小菜蛾幼虫的死亡率分别为18.18%、33.31%、87.88%,要显著高于未突变基因处理组。亚洲玉米螟幼虫室内杀虫活性的生物鉴定结果表明24h、48h、72h实验组幼虫死亡率分别为12.22%、23.89%、81.11%。并且存活玉米螟幼虫生长发育严重受到抑制,72h后实验组单只活虫重量仅为0.18g,是处理前7%,而空载体对照组单只活虫重量为0.252g是处理前98%。