肝脏是一个独特的器官,它既是人体最大的代谢和解毒器官,同时也被认为是机体重要的免疫器官。与其它免疫器官主要诱导免疫应答不同,肝脏更倾向于诱导免疫耐受如口服免疫耐受,肝脏移植耐受等。一些病原菌如乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)和疟疾等利用肝脏诱导免疫耐受的特性在肝脏局部形成慢性感染,严重危害人类健康。HBV主要感染肝实质细胞,部分人群感染HBV后会导致终生携带,HBV携带者对HBV疫苗处于免疫耐受状态。长期以来,人们对于HBV诱导免疫耐受的机理研究主要基于HBV转基因鼠,但HBV转基因鼠免疫系统从胚胎期对HBV病毒就完全处于免疫耐受状态,与人类后天感染HBV状态有较大差别。本研究中我们采用pAAV/HBV1.2质粒高压注射的方式建立HBV慢性携带小鼠动物模型,研究了HBV慢性携带诱导外周免疫耐受的机理和HBV感染初期肝脏局部微环境改变对HBV免疫耐受的影响。一方面,我们发现Kupffer细胞在诱导HBV携带鼠外周免疫耐受过程中发挥重要作用；另一方面,肝脏过表达IL-15能够预防pAAV/HBV1.2质粒高压注射形成的免疫耐受状态。本研究中,我们采用对C57BL/6小鼠高压注射pAAV/HBV1.2质粒的方式建立HBV持续携带动物模型,模拟人类HBV慢性感染状态。运用放射免疫方法定量检测血清中HBsAg、HBeAg、Anti-HBs含量,免疫组化方法检测肝脏组织HBcAg表达,荧光定量PCR方法检测血清中HBV DNA含量,利用以上指标评价pAAV/HBV1.2质粒高压注射后HBV携带情况；通过细胞清除、细胞纯化和细胞转输实验观察特定细胞亚群在HBV诱导外周免疫耐受过程中的作用；采用构建重组表达质粒和高压注射的方式在小鼠体内内源性过表达IL-15；利用流式细胞术检测各细胞亚群的变化特征；利用ELISA方法检测血清中细胞因子含量的变化。采用上述研究方法,我们得到了以下结果：Kupffer细胞介导HBV免疫耐受。pAAV/HBV1.2质粒高压注射小鼠后血清中能检测到HBsAg、HBeAg持续表达,高压注射6周后肝脏组织仍可以检测到HBcAg蛋白,血清转氨酶在HBV质粒携带过程中一直维持在正常水平,这暗示HBV质粒携带鼠的免疫状态与处于免疫耐受状态的人类慢性HBV携带者的免疫状态相似。与人类HBV感染现象相一致,我们发现HBV疫苗预先免疫可以促进小鼠排斥HBV; HBV质粒携带鼠在HBV疫苗免疫后,不能产生Anti-HBs, HBV疫苗免疫也不能促进HBV质粒携带鼠排斥HBV,这表明肝脏表达HBV诱导外周对HBV疫苗处于免疫耐受状态。进一步我们对HBV质粒携带鼠免疫非HBV蛋白抗原OVA,发现HBV携带鼠可以对OVA产生免疫应答,这说明肝脏表达HBV诱导外周免疫耐受只针对HBV蛋白,是抗原特异性的。我们将HBV质粒携带鼠和对照鼠的脾脏淋巴细胞转输到获得性免疫系统缺陷的Rag1-/-鼠中,在Rag1-/-鼠上分别重建它们的外周免疫系统,观察重建的免疫系统对HBV疫苗的反应。实验结果表明,重建了对照鼠免疫系统的Rag1-/-鼠能对HBV疫苗产生应答,而重建了HBV携带鼠免疫系统的Rag1-/-鼠不能对HBV疫苗产生应答。接着,我们将HBV携带鼠脾脏淋巴细胞中的CD4+T细胞替换为对照鼠的CD4+T细胞,再转输给Rag1-/-,发现对照鼠的CD4+T细胞能辅助HBV携带鼠的获得性免疫系统对HBV疫苗产生免疫应答。这暗示HBV携带鼠免疫耐受状态可能是由于其CD4+T细胞功能缺陷造成的。肝脏抗原递呈细胞被证明在诱导肝脏免疫耐受过程中起重要作用。HBV携带鼠的非实质细胞转输到Naive鼠中能诱导受者鼠对HBV疫苗低免疫应答,进一步将肝脏非实质细胞分为Kupffer细胞和非Kupffer细胞再分别进行转输,我们发现Kupffer细胞具有很强的诱导受者鼠低免疫应答的能力,这表明Kupffer细胞介导了HBV免疫耐受。不过,检测Kupffer细胞在pAAV/HBV1.2质粒高压注射前后的变化情况,我们发现Kupffer细胞的状态并没有显著改变,这暗示肝脏Kupffer细胞一直处于诱导免疫耐受的状态。肝脏过表达IL-15诱导产生IFN-β预防HBV免疫耐受为了研究IL-15对HBV免疫耐受的影响,我们构建了含IL-15基因表达框的pLIVE-IL-15质粒,通过高压注射的方式使pLIVE-IL-15质粒在小鼠体内过表达IL-15。实验结果表明,pLIVE-IL-15质粒高压注射小鼠后能在体内长期表达。若将pLIVE-IL-15质粒或对照质粒pLIVE-EGFP与pAAV/HBV1.2质粒一起注射到小鼠体内,我们发现对照质粒组小鼠血清中长期表达HBsAg和HBeAg,而pLIVE-IL-15质粒注射组血清中低表达HBsAg和HBeAg并且HBV最终会被清除。这表明IL-15能有效预防HBV免疫耐受状态形成。IL-15是一种多能性细胞因子,对天然免疫系统细胞和获得性免疫系统细胞都具有调节作用。pLIVE-IL-15质粒在Rag1-/-鼠中仍能有效地抑制HBV表达,这表明IL-15发挥抗HBV功能不依赖于获得性免疫系统。尽管脾脏和肝脏NK细胞在IL-15质粒注射后数目有较大提升,但采用PK136抗体清除NK/NKT细胞并不影响IL-15抗HBV功能,采用IL-2Rγc-/-鼠实验也表明IL-15抗HBV能力不依赖于NK细胞。IFN-γ和IFN-α/β均可以抑制HBV表达。IL-15在IFN-γ缺陷鼠中仍具有抗HBV功能,这表明IL-15抗HBV能力不依赖于IFN-γ。研究发现,肝脏IFN-β mRNA和血清IFN-β蛋白水平在IL-15质粒注射后显著上调,而肝脏IFN-amRNA和血清IFN-α蛋白水平在IL-15质粒注射后变化不明显。进一步采用Anti-IFNAR1抗体阻断IFN-β功能可以完全逆转IL-15的抗HBV作用,这说明IL-15抗HBV功能依赖于IFN-β。Clodronate Lyposomes青除巨噬细胞不会改变IL-15的抗HBV作用,暗示IFN-β并不是由IL-15作用于巨噬细胞产生的。结论：pAAV/HBV1.2质粒高压注射模型很好地模拟了人类HBV慢性感染状况,可以用于研究HBV感染诱导外周免疫耐受的现象及机理。我们发现HBV免疫耐受状态与CD4+T细胞功能缺陷相关,Kupffer细胞在诱导HBV免疫耐受过程中发挥关键作用。细胞因子IL-15通过诱导产生IFN-β有效预防HBV免疫耐受状态的形成。本研究对于认识肝脏独特的免疫耐受特性,对于理解HBV慢性感染诱导外周免疫耐受的机理及HBV治疗都具有一定意义。