研究背景糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)作为糖尿病最常见的微血管并发症之一,是导致终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的重要原因。越来越多的证据显示肾小管间质病变是DN发生发展的独立危险因素。因此,研究糖尿病时肾小管、肾小管周毛细血管(Peritubular Capillary,PTC)及间质微环境改变的机制和效应,有助于寻找治疗DN新的干预位点。腺苷1型受体(A1 Adenosine Receptor,A1AR)在肾脏广泛表达,因其在肾脏管球反馈(Tubulo-glomerular Feedback,TGF)中的重要调控作用而受到广泛关注,我们前期研究观察到DN时,A1AR基因敲除,加重DN但与TGF无关。而在造影剂肾病和缺血再灌注动物模型中,观察到A1AR存在不依赖于管球反馈的肾脏保护作用,DN时是否存在相似的情况,具体机制并不清楚。研究目的本研究将通过DN患者、A1AR基因敲除(A1AR-/-)DN小鼠动物模型和体外细胞实验,从组织器官、细胞和分子水平观察A1AR缺失对于DN肾小管周微环境(肾小管、间质和肾小管周毛细血管)非依赖于管球反馈的损伤机制,了解激活A1AR对蛋白尿发生和肾脏纤维化机制的保护作用。1.建立A1AR缺失DN小鼠动物模型,通过肾脏mRNA基因芯片谱检测筛选差异表达基因,寻找A1AR参与DN发展的可能分子调节通路;2.在DN患者、小鼠模型中观察A1AR缺失加重肾小管周微环境损伤,保护刷状缘转运蛋白Megalin破坏和小管间质纤维化的可能机制;3.体外细胞培养验证A1AR对高糖环境下近端小管上皮细胞损伤的保护作用;进而为DN防治提供新的思路和潜在的干预位点;4.观察A1AR在DN水盐代谢相关高血压中的调节作用及可能机制。研究方法第一部分 DN模型的确立及A1AR参与DN的分子通路初筛1.纳入肾活检证实为糖尿病肾病患者,年龄性别匹配的肾小球轻微病变作为对照组,分析其临床病理特点,收集患者尿液提取外泌体进行形态、粒径及标志物的鉴定,免疫印迹法检测尿外泌体中A1AR及SGLT2蛋白;免疫荧光染色确定A1AR在DN患者肾脏的表达部位,免疫组化及半定量分析评估DN患者和动物A1AR与对照组的表达差异。2.分别在C57/BL野生型及管球反馈缺失的A1AR-/-小鼠中,通过腹腔注射链脲佐菌素120mg/kg建立1型DM动物模型,选择不同时间点,血糖试纸检测血糖、代谢笼留取24h尿标本、尾夹法监测血压;观察体重、血糖及尿量的变化,检测尿白蛋白水平;常规病理染色及透射电镜观察野生型及A1AR缺失DM小鼠肾脏小球、小管、血管及间质损伤,评估DN模型的建立。3.将野生型对照组、野生型糖尿病肾病组,A1AR-/-对照组与A1AR-/-糖尿病肾病组四组肾皮质组织,提取RNA进行mRNA基因芯片谱测序,筛选差异基因进行KEGG通路聚类分析,寻找A1AR参与DN损伤的可能分子通路。第二部分 A1AR在糖尿病肾病小管周微环境稳态中的保护作用1.透射电镜观察DN小鼠肾间质血管与周细胞的位置关系,免疫荧光染色观察DN患者血管内皮细胞(CD34)、周细胞(PDGFRβ)及A1AR表达的位置关系;免疫组化染色评估肾小管管周毛细血管与周细胞损伤;免疫印迹法评估周龄野生型和A1AR-/-DN小鼠肾皮质A1AR及A2AR的蛋白表达差异。观察A1AR缺失对PTC及细胞紧密连接蛋白表达的影响,免疫组化染色半定量分析周细胞PDGFRβ、淋巴管podoplanin与炎症巨噬细胞(F4/80)的关系。2.光镜和电镜观察DN患者和小鼠病理特点,利用免疫荧光染色对DN患者中A1AR与Megalin位置关系进行定位,观察DN患者和动物近端小管Megalin与cubilin损伤与蛋白尿的关系;评估A1AR缺失对该病变的影响;3.常规病理染色评估DN小鼠肾脏纤维化及细胞外基质沉积,利用免疫荧光双观察DN患者肾脏A1AR与胶原蛋白I的位置关系;免疫印迹法检测A1AR缺失对Caspase1/IL18焦亡及NLRP3/IL1β炎症小体信号通路蛋白的表达水平的影响,肾小管间质促纤维化因子TGFβ及胶原蛋白(I/III/IV)的表达量变化,评估A1AR缺失DN小管间质炎症反应及纤维化的作用。第三部分 A1AR对高糖环境中近端小管上皮细胞损伤的保护机制1.DMEM/F12培养基体外培养人近端小管上皮细胞系,至细胞80-90%融合时,倒置显微镜观察其形态学特征,免疫荧光常规行细胞鉴定(CK18,Megalin);2.高糖、等渗甘露醇和低糖分别与细胞共培养24h,免疫荧光检测NLRP3,Caspase1/ICollagen1表达水平,评估高糖环境对近端小管上皮细胞的损伤作用。L18表达,评估近端小管上皮细胞炎症反应。72h收集细胞裂解液提取蛋白,western blot检测小管上皮细胞标志物Megalin、紧密连接蛋白Occludin、巨噬细胞分泌的炎症因子蛋白NLRP3/IL18、促纤维化因子TGFβ及胶原蛋白3.加入不同浓度的A1AR激动剂(CCPA)或A1AR抑制剂(DPCPX)与细胞共孵育,CCK-8及LDH释放试验方法分别检测二者细胞增殖与毒性,选择合适的浓度与高糖培养的细胞共孵育,Western blot检测CCPA与DPCPX对近端小管上皮细胞紧密连接蛋白(Occludin)、炎症因子(NLRP3/Caspase1/IL18)及胶原蛋白Collagen1水平的变化。第四部分 A1AR在DN水盐代谢异常相关高血压中的调节作用1.观察记录DN患者及小鼠中血压变化情况,免疫荧光染色确定DN患者中调节水盐平衡转运子及调节激酶SGK1的表达部位(SGK1\NCC\NKCC2\SGLT2),免疫组化染色及半定量分析评估DN患者及小鼠肾脏各水钠转运子在DN中的表达情况;2.DN小鼠动物模型中观察A1AR-/-对血压的影响,免疫组化染色及免疫印迹法评估 A1AR 缺失对水盐转运子调节酶 SGK1及各转运子(NCC\NKCC2\SGLT2\rENac)表达的影响。统计方法采用SPSS 14.0软件进行统计分析(SPSS,Chicago,IL),符合正态分布的计量资料以均值±标准差表示。两组间比较采用t检验,自身前后比较采用配对t检验;三组或以上比较使用单因素或多因素变量分析,采用双侧检验的方法,P<0.05为有统计学意义。研究结果第一部分 DN模型的确立及A1AR参与DN的分子通路初筛1.本研究纳入13例DN患者,平均24h尿蛋白定量5.7±3.8g,平均血肌酐129.6±61.2umol/L,DN典型肾脏病理表现为肾小球及小管基底膜弥漫性增厚,K-W结节形成,血管壁增厚伴玻璃样变,小管间质局灶性炎细胞浸润及纤维化。成功提取尿液外泌体,电镜下呈典型双膜结构、平均直径100nm(质谱法),western blot法出检测到外泌体标志性蛋白TSG101,及小管标志物SGLT2、A1AR及NCC,提示尿液外泌体可以检测到肾小管上转运子损伤。免疫荧光观察到A1AR染色主要表达于近端小管上皮细胞。与GML组相比,DN患者肾小管A1AR表达增加约1.38倍。2.链脲佐菌素注射3天后检测到野生型及A1AR-/-小鼠实验组血糖显著升高,大于16.7mmol/L,持续16周,伴有多饮多食多尿,达到DM诊断标准。肾脏重量显著增加伴体重下降,24h尿白蛋白排泄率增加(129.4±12.2比16.7±2.5 μg/d,P<0.001),光镜及透射电镜可观察到肾小球与小管肥大、基底膜的显著增厚,血管壁增厚与小管间质纤维化,符合DN的特点。且A1AR-/-DN组较野生型WT-DN 组蛋白尿更多(183.8±9.7 比 129.4±12.2μg/d,P<0.001);3.WT-Control,WT-DN,A1AR-/--Control 与 KO-DN 四组小鼠肾皮质组织 mRNA基因芯片谱测序及差异基因KEGG通路富集分析结果提示:A1AR参与DN损伤主要分子机制涉及“细胞因子通路、蛋白内吞通路与细胞外基质沉积”;第二部分 A1AR在糖尿病肾病小管周微环境稳态中的保护作用1.免疫荧光共染提示周细胞标志物PDGFRβ表达在微血管内皮细胞(CD34阳性)外侧,在DN患者及小鼠动物模型中观察到周细胞与血管内皮细胞的分离,PDGFRβ表达增加(24.5±0.6%比13.2±0.5%),伴有细胞紧密连接蛋白Occludin及CD34表达下降(20.4±0.3%比27.6±0.2%)。肾小管间质可见炎症巨噬细胞浸润,提示糖尿病小管周微环境稳态破坏;2.A1AR在近端小管、血管内皮细胞及间质炎症细胞上均有表达,DN小鼠肾脏A1AR表达为对照组的1.38倍(P<0.05)。A1AR-/-DN小鼠肾脏CD34缺失和紧密连接损害较 WT-DN 更重(CD34:0.3±0.03 比 0.6±0.08 比 1.0±0.05,P<0.001;Occludin:0.4±0.06 比 0.7±0.04 比 1.0±0.03,P=009);3.免疫荧光结果提示近端小管上皮细胞上A1AR与megalin共表达,透射电镜观察到随着周龄的增加,DN小鼠近端小管刷状缘侧微绒毛结构缺失。在DN患者和小鼠中观察到megalin-cubilin损伤,与蛋白尿呈负性相关(DN患者r=-0.862,P=0002;DN小鼠r=-0.927,P<0.001),损伤程度随周龄增加而进一步加重。同样A1AR缺失进一步加重DN小鼠megalin-cubilin损伤及蛋白尿;4.光镜和电镜下可观察发现WT-DN小鼠肾小管间质大量细胞外基质沉积和微丝状结构,免疫组化TGFβ1与Collagen(I,III,IV)染色证实其胶原成分。western-blot检测到焦亡相关Caspase1/IL18表达量增加;A1AR-/--DN小鼠中Caspase1/IL18 蛋白表达量进一步增加(1.52±0.6 比 1.24±0.3 比 1.0±0.2,P=0.017;1.51±0.3 比 1.3±0.2 比 1.0±0.2,P=0.018),小管间质纤维化也进一步加重。第三部分 A1AR对高糖环境中近端小管上皮细胞损伤的保护机制1.倒置显微镜下单个近端小管上皮为多边形或椭圆形,融合后呈鹅卵石样铺路石状,免疫荧光染色可检测到细胞CK18及megalin均呈阳性,提示所培养细胞为肾脏近端小管上皮细胞;2.高糖共培养24h后,免疫荧光染色可观察到巨噬细胞标志物CD68和NLRP3/Caspase1/IL18表达。高糖共培养72h,免疫印迹检测提示高糖组A1AR表达为对照组的1.8倍,相同渗透压的甘露醇并不增加A1AR表达。同时刷状缘Megalin(0.46±0.03 比 1.1±0.05,P=0.008)与紧密连接蛋白 Occludin(0.6±0.02 比 1.0±0.03,P=0.023)表达明显降低,而NLRP3/IL18分别为对照组的4倍与2.5倍,伴有TGFβ表达量增加2倍;3.根据细胞增殖、毒性试验结果,选择0.1ummol/L的CCPA(A1AR激动剂)与0.1umol/L的DPCPX(A1AR抑制剂)分别与小管上皮细胞共孵育24h,western blot法证实CCPA可明显抑制高糖环境诱导的炎症因子NLRP3(0.4±0.03比1.0±0.06,P=0.032);Caspase-1(0.6±0.02 比 1.0±0.01,P=0.007),IL 18(0.7 ± 0.05 vs 1.0±0.04,P=0.045)水平,上调胶原蛋白 Collagenl(0.6±0.02 比 1.0±0.02,P=0.024)的表达。与此相反,A1AR抑制剂DPCPX可进一步加重上述损伤。第四部分A1AR在DN水盐代谢异常相关高血压中的调节作用1.本研究纳入的DN患者及DN小鼠均伴有高血压的发生,免疫荧光显示DN患者中肾脏NCC、NKCC2、SGLT2与rENac均表达于肾小管刷状缘侧,免疫组化染色及半定量分析结果显示与GML组相比,DN组NKCC2(1.6±0.3比1.0±0.2,P<0.001)与 SGLT2(1.3±0.3 比 1.0±0.2,P=0.042)表达显著增加,伴有调节激酶SGK1表达增加(1.32±0.2比1.0±0.3,P=0.041),而NCC表达无明显差异;2.A1AR-/--DN 小鼠血压更重(127±9.4 比 118±6.0 比 106±8.5 mmmHg,P<0.001),免疫组化染色及western blot结果显示A1AR缺失加重NCC(38 ±4.5比20±2.0 比 10±0.6%,P<0.001)、NKCC2(36±5.2 比 20±2.3 比 16±0.8%,P<0.001)与 rENac(1.32±0.1 比 0.8±0.3 比 1.0±0.1,P=0.02)表达上调,而A1AR缺失后水盐转运子调节酶SGK1表达量无明显变化。结论本研究条件下1.A1AR在糖尿病肾小管、小管周毛细血管-周细胞及间质组成的肾小管周微环境稳态损伤中具有保护作用;2.A1AR缺失导致局部巨噬细胞浸润相关的炎症反应(Caspase1/IL18),加重肾小管megalin损伤相关蛋白尿,以及周细胞与血管内皮细胞分离诱导的小管间质纤维化;3.A1AR激动剂有助于改善该微环境稳态和炎症反应,减轻上述病理生理过程,与之相反A1AR抑制剂会进一步加重此损伤;4.DN及小鼠血压升高与肾脏水盐转运子表达异常相关,A1AR缺失小鼠血压更高,A1AR主要通过调节管球反馈参与水钠平衡及血压的调节,与SGK1无关。