目的:缺血缺氧引起的脑损伤具有致残率高、发病机制复杂等特点,虽然目前认为氧化应激和炎症反应是缺血缺氧性脑损伤的重要原因,但其确切发病机制尚不十分清楚,药物治疗效果也不太理想。通心络(Tongxinluo,TXL)胶囊系根据古代医家络病理论,以益气活血、通络止痛为治疗原则研制而成的中药复方制剂。通心络在心血管疾病的临床治疗上应用广泛且效果显著;而且,各种临床研究已证实,通心络在老年脑动脉硬化、头痛、脑梗死等脑血管疾病的治疗上也取得了良好的疗效。虽然,通心络对缺血缺氧性脑损伤具有保护作用,但其作用机制目前尚不清楚。本实验研究在动物模型和细胞水平上研究通心络对脑组织和小胶质细胞缺血缺氧性损伤的保护作用及其作用机制,为通心络用于防治缺血缺氧性脑损伤提供有力的理论依据。方法:选取雄性Apo E-/-小鼠,随机分为正常对照组、高脂饮食组和高脂+通心络治疗组。用高脂饲料饲喂Apo E-/-小鼠,制备动脉粥样硬化诱发的脑缺血缺氧动物模型。通心络治疗组按7.5 mg/10 g体重每天给予通心络超微粉混悬液灌胃。对照组和高脂组每天灌服同等剂量的生理盐水。连续灌注3个月后取材,TTC染色和HE染色检查缺血性脑损伤动物模型是否成功。TTC染色是评价脑缺血损伤的常用指标,正常脑组织呈鲜红色,梗死区脑组织呈苍白色。利用Western blot和RT-PCR分析检测脑组织HIF-1a、NRG-1、HO-1以及转录因子KLF5和KLF4的表达。在细胞水平上,用软脂酸(C16:0)刺激神经小胶质细胞(BV2)不同时间后,利用Western blot和RT-PCR检测细胞HIF-1a、NRG-1、HO-1以及转录因子KLF5和KLF4的表达。BV2细胞放入三气培养箱中低氧培养不同时间,利用Western blot和RT-PCR检测细胞HIF-1a、NRG-1、HO-1以及KLF5和KLF4的表达。细胞爬片经免疫荧光染色检查HIF-1a、NRG-1、HO-1、KLF5的表达。敲低KLF5,Western blot分析检测HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达。结果:1脑组织缺血缺氧可以诱导HIF-1a、NRG-1、HO-1蛋白和m RNA的表达,通心络干预后,HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白和m RNA水平均显著下调。TTC染色结果可见,正常对照组脑组织均匀红染;高脂饮食组可见明显的梗塞区域;高脂饮食+通心络组梗塞区域显著减少。HE染色结果显示,正常对照组脑组织形态结构正常,椎体细胞呈椭圆形,核仁明显;高脂饮食组神经元细胞高度水肿,呈空泡状,细胞核浓染,固缩,梗塞中心区淡染,说明神经元细胞严重损伤;通心络组神经元细胞损伤有所降低。以上结果表明,脑组织缺血模型制备成功。Western blot分析结果显示,与正常对照组相比,高脂组HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达明显上调;与高脂组相比,高脂+通心络组HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达显著下调。这说明通心络能部分逆转缺血对HIF-1a、NRG-1和HO-1的诱导作用。RT-PCR分析结果发现,与正常对照组相比,高脂组HIF-1a、NRG-1、HO-1的m RNA水平升高,而与高脂组相比,高脂+通心络组HIF-1a、NRG-1、HO-1的m RNA水平明显下降,这与Western blot结果相一致。2体外培养的BV2小胶质细胞,缺氧促进HIF-1a、NRG-1、HO-1蛋白和m RNA的表达,通心络可逆转缺氧对HIF-1a、NRG-1、HO-1表达的上调作用。为了进一步验证在模型动物上获得的结果,我们以BV2细胞作为研究对象,BV2细胞经软脂酸C16:0刺激不同时间后,Western blot分析结果显示,HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白表达随着C16:0刺激时间的延长而增加;RT-PCR分析的结果也显示,HIF-1a、NRG-1、HO-1的m RNA水平也随着C16:0刺激时间的增加而升高。为了研究缺氧对BV2细胞的影响,BV2细胞放入三气培养箱中进行低氧培养不同时间,然后,Western blot分析结果显示,低氧以时间依赖性的方式诱导HIF-1a、NRG-1和HO-1表达;用RT-PCR对HIF-1a、NRG-1和HO-1 m RNA进行检测的结果与其蛋白质水平的变化趋势相一致。用不同浓度的TXL预孵育BV2细胞24 h,然后再低氧培养36 h,Western blot分析结果显示,通心络能够浓度依赖性的逆转由缺氧诱导的HIF-1a、NRG-1、HO-1的上调;用RT-PCR对相应m RNA进行检测的结果与其蛋白质水平变化的趋势相一致。细胞免疫荧光染色结果也显示,与对照组相比,缺氧条件下培养36 h后,HIF-1a、NRG-1、HO-1免疫荧光染色强度显著增加,与通心络预孵育后再进行缺氧培养,HIF-1a、NRG-1、HO-1免疫荧光染色强度显著减少。这些结果表明,缺氧可以显著诱导HIF-1a、NRG-1、HO-1表达,通心络干预后,HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达均显著下调。3缺血缺氧诱导转录因子KLF5的表达,通心络能逆转缺氧对KLF5表达的诱导作用。上述结果表明,缺血缺氧能诱导HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达,那么,HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达是否受KLF5和KLF4的调控呢?Western blot分析结果显示,与正常对照组相比,高脂组小鼠的KLF5表达明显上调;与高脂组相比,高脂+通心络组的KLF5的表达显著降低。而与正常对照组相比,高脂组和高脂+通心络组的KLF4的蛋白表达无明显变化。用RT-PCR对KLF5和KLF4 m RNA进行分析的结果与其蛋白质水平的变化趋势相吻合。这些结果说明,缺氧诱导HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达可能与转录因子KLF5的表达上调有关。4缺氧诱导BV2细胞对转录因子KLF5的表达,通心络能消除缺氧对KLF5的表达的诱导作用。为了探讨缺氧引起的HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达上调是否与KLF5和KLF4表达有关,我们在缺氧条件下培养BV2细胞,Western blot结果显示,缺氧以时间依赖的方式上调KLF5蛋白表达,但KLF4表达受缺氧影响不太明显。用RT-PCR检测KLF5和KLF4 m RNA表达的结果与其蛋白水平的变化相一致。用不同浓度的TXL预孵育BV2细胞24 h后再缺氧培养36 h,由缺氧诱导的KLF5上调随着TXL浓度的增加而逐渐逆转,而KLF4随着TXL浓度的变化其蛋白表达无明显变化。同样,m RNA水平的检测结果与蛋白水平的变化趋势相一致。细胞免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,缺氧36 h后,KLF5免疫荧光染色强度显著增加,通心络预孵育能使KLF5免疫荧光染色强度显著减少。这些结果表明,缺氧诱导HIF-1a、NRG-1和HO-1表达与其上调KLF5的表达有关。5在缺氧条件下HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达受KLF5的调控。上述结果表明,由缺氧引起的HIF-1a、NRG-1、HO-1表达上调可能与转录因子KLF5的表达有关。为了进一步探讨HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达是否受KLF5的调控,我们用靶向小鼠的KLF5 si RNA转染BV2细胞,敲低KLF5表达后,检测HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白表达。Western blot分析结果显示,KLF5缺失消除了缺氧诱导的HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达上调。这些结果表明,在缺血缺氧的脑组织和BV2细胞中,KLF5介导缺氧诱导HIF-1a、NRG-1和HO-1表达。结论:1脑组织缺血缺氧可以诱导HIF-1a、NRG-1、HO-1蛋白和m RNA的表达,通心络干预后,HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白和m RNA水平均显著下调。2体外培养的BV2小胶质细胞,缺氧促进HIF-1a、NRG-1、HO-1蛋白和m RNA的表达,通心络可逆转缺氧对HIF-1a、NRG-1、HO-1表达的上调作用。3缺血缺氧诱导转录因子KLF5的表达,通心络能逆转缺氧对KLF5表达的诱导作用。4缺氧诱导BV2细胞对转录因子KLF5的表达,通心络能消除缺氧对KLF5的表达的诱导作用。5在缺氧条件下HIF-1a、NRG-1、HO-1的表达受KLF5的调控。