论文部分内容阅读
表皮生长因子受体(EGFR)作为一种众所周知的治疗性肿瘤靶点,已在多种肿瘤(如肺癌)的治疗中发挥重要作用。当前已开发了两种主要的EGFR靶向策略:EGFR单克隆抗体,例如西妥昔单抗,它们能够直接与EGFR胞外域上配体结合位点结合,干扰下游信号通路的激活;EGFR酪氨酸激酶抑制剂,例如厄洛替尼,可以与EGFR的胞内酪氨酸激酶位点结合,抑制磷酸化激活。然而,尽管肝细胞癌中EGFR表达量通常很高,但目前尚未证明上述EGFR靶向治疗药物在肝细胞癌中具有积极评价。有报道指出复杂的信号通路是肝癌细胞耐药性的主要原因。目前,国际公认的能够使肝细胞癌患者受益的唯一药物是索拉非尼。由于能够抑制多种胞内途径,索拉非尼具有一些缺点,诸如副作用大、生存期短等。因此,在肝细胞癌临床治疗中仍然缺乏更具针对性的靶向药物。EGFR的内化十分复杂,大多数研究均集中在其内化的途径和强度上。根据过往的报道,EGFR可以通过各种内化途径进入细胞,单克隆抗体的联用能够诱导发生更多的EGFR内化。一种包含两个与EGFR不同表位结合抗体的联合抗体——称为Sym004,该协同抗体组合能够诱导EGFR发生快速内化和降解,进而导致EGFR下调并抑制随后的肿瘤细胞生长。2017年,Sym004在转移性结肠直肠癌的患者中通过了临床II期试验,对已获得EGFR治疗耐药性或RAS/BRAF突变耐药性的患者,Sym004可以提供明显的生存获益。综上可以看出,EGFR的快速内化和胞内再循环的阻断可能是开发应用于肝细胞癌治疗的EGFR靶向药物的新策略和新方向。本论文首先研究了一种来自灵芝的免疫调节蛋白(rLZ-8)在肝细胞癌的抗肿瘤活性。在体外实验中,rLZ-8能够抑制肝细胞癌细胞系Hep3B细胞的生长;体内实验中,rLZ-8能够显著地抑制裸鼠原位肝细胞癌模型的肿瘤生长,且抑瘤率高于索拉非尼给药组;同时,rLZ-8能够延长裸鼠原位肝细胞癌模型的生存期,提高小鼠的存活率。因此,rLZ-8对肝细胞癌具有明显的抗肿瘤活性。本论文接下来对rLZ-8的抗肿瘤机制进行了研究。通过超高分辨率成像及多项胞内成像学研究,结果发现rLZ-8能够引发大量而快速的囊泡内化进入Hep3B细胞,之后证明该内化方式为巨胞饮;胞内的定位追踪显示,rLZ-8入胞后不与溶酶体发生融合,囊泡滞留于晚期内吞体阶段,并引起细胞膜循环的阻滞,Hep3B细胞因此不断皱缩和破裂死亡。其中rLZ-8的高强度内化和细胞膜循环的阻滞为该杀伤机制的关键点,而这种剧烈内化很可能是由某种细胞膜受体介导引起。通过胞内多种细胞膜受体与rLZ-8共定位观察,表明EGFR是rLZ-8在肝细胞癌细胞中的主要受体;肝细胞癌PDX模型的药效学与EGFR表达趋势的相关性分析可知,EGFR的表达量与rLZ-8的肿瘤抑制率呈正相关的关系;通过PLA二聚化检测和信号通路激酶磷酸化检测实验,证明rLZ-8与EGFR特异性结合后,并未引起EGFR的二聚化以及胞内下游信号通路的激活。之前的结果显示rLZ-8能够通过高强度的内化和细胞膜循环的阻滞引起肿瘤细胞死亡,而EGFR其他抗体并未发生这种大量内化,造成这种差异的原因很可能源自于二者与EGFR结合位点的区别,因此接下来应对rLZ-8和EGFR作用位点进行研究。通过筛选得到与rLZ-8具有竞争表位的EGFR新抗体,该抗体在Hep3B细胞中能引起大量内化,且内化强度远大于Cetuximab和mAb806等其他EGFR抗体;接下来通过化学交联结合质谱和分子对接技术,表征和计算出rLZ-8上与EGFR结合关键位点可能为(S18、D20、K41),EGFR上关键位点可能为(S196、S222、K269、S282);根据上述表征结果,设计并构建表达出rLZ-8和EGFR关键位点突变体蛋白,Biacore分子互作结果显示,rLZ-8中K41位点为主的相关突变体与EGFR的亲和力降低很多,其在Hep3B细胞中的内化能力也远弱于野生型rLZ-8,在细胞膜上几乎不与EGFR发生结合,表明K41是rLZ-8结构上与EGFR识别的关键氨基酸位点;Biacore分析显示上述构建好的EGFR胞外域突变体蛋白与rLZ-8间的亲和力弱于野生型EGFR胞外域;在构建出表达EGFR野生型和突变体的NIH-3T3细胞株后,观察发现细胞膜上rLZ-8与EGFR突变体的结合能力明显弱于野生型EGFR,表明S222/K269是EGFR上能与rLZ-8结合的关键氨基酸位点。综上,本论文发现rLZ-8对肝细胞癌具有明显的抗肿瘤活性,且通过与EGFR上S222/K269位点结合,引发了一种以高强度内化和细胞膜循环阻滞为主要特点的杀伤肝细胞癌的作用机制。因此本论文发现和表征了可用于肝细胞癌治疗的EGFR新表位,该表位可引发强烈的EGFR内化及胞内细胞膜循环的阻滞。EGFR靶向治疗新表位的发现,将为肝细胞癌临床治疗中更有效的EGFR靶向药物的设计和开发提供新靶点,同时EGFR结构域的相关特征指标将为EGFR单克隆抗体和EGFR靶向抗体-药物偶联物的开发提供一个优化方向。本论文的研究结果进一步显示出EGFR的快速内化是能够使EGFR靶向治疗效果最大化的一种极具潜力的靶向治疗策略,与目前临床使用的EGFR靶向药物相比,该机制可能更适用于肝细胞癌的临床治疗。