超抗原是一类强大的免疫激活剂,它无需抗原提呈细胞的加工处理,而是以完整的蛋白质形式结合于MHC-Ⅱ类分子沟槽外侧,激活大量的T细胞,同时产生大量细胞因子。超抗原的这种高效免疫活性,使其成为一种新的肿瘤免疫治疗模式。我们的实验室多年来一直致力于肿瘤免疫治疗的研究,通过克隆SEA基因,对SEA进行原核表达、分离纯化,制备了活性较高的SEA蛋白;利用纳米乳剂为载体包裹肿瘤特异性抗原MAGE-1-HSP70融合蛋白与SEA配比制备出一种新型肿瘤纳米疫苗,并研究了其理化和生物学特性以及抗肿瘤免疫效应;同时构建了肝癌靶向性SEA/CD80基因共表达重组腺病毒载体,在动物实验中发现其能有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应。但是在进一步的研究中人们发现,超抗原的多次刺激导致了T细胞的免疫耐受,即一部分抗原特异性的T细胞发生程序性死亡,余下的抗原反应性T细胞对超抗原的再次刺激表现为无反应性,即无能。超抗原的这一特性给人们带来了负面影响,限制了其在肿瘤治疗中的应用,因此超抗原的理论和作用机制的研究又成为热点。但是要想将超抗原SEA免疫治疗应用于临床,只研究理论机制是不够的,超抗原本身的剂量、途径和使用方法等对体内外T细胞免疫效应的正负影响及规律,对于SEA的临床实际应用同样具有重要的指导意义,而这在国内外尚未见系统地研究报道,也是我们研究肿瘤超抗原疫苗的一个空缺。因此本研究的目的就是通过建立小鼠体内和体外无能T细胞模型,从增殖反应、细胞膜表型变化和细胞因子的合成与释放等方面系统全面地探讨超抗原SEA影响T细胞应答反应的量效关系及规律特点,为超抗原在肿瘤临床免疫治疗中的合理而有效地应用提供理论依据。实验内容主要概括如下:1.超抗原SEA对小鼠脾淋巴细胞活化和增值的体内外影响目的:分别用SEA单次刺激体内或体外培养的小鼠脾淋巴细胞,观察SEA促进淋巴细胞活化和增殖的规律和特点。方法:①采用MTT法测定SEA刺激后脾淋巴细胞的增殖反应。②通过FACS检测SEA初次刺激后脾淋巴细胞膜表型的变化。③用CTLL-2细胞测定细胞培养上清或血清中IL-2的活性,并用FACS检测细胞内IL-2的水平。结果:在体外,使脾淋巴细胞显著增殖的SEA浓度范围是1-1000ng/ml,选择100ng/ml作为观察SEA体外刺激能力的最佳剂量,其既能刺激T细胞的显著增殖,又不会导致过早的细胞死亡。在体内,根据对T细胞刺激程度和效力维持时间,选择腹腔注射为最佳注射途径;SEA剂量在5-15μg范围内均能促进CD3表达显著上升,最佳剂量为10μg。体内外结果均显示,SEA单次刺激促进了T细胞活化的主要膜表面分子(CD69和CD25)的表达显著升高,使CD4与CD8的表达同步上升,IL-2的合成和释放快速增加。结论:在一定浓度范围内的SEA对体内外的T细胞均具有强烈的活化和增殖作用,其对CD4和CD8亚群具有相同的增殖效果。为下一步研究超抗原诱导T细胞无能的实验提供依据和设计思路。2.超抗原SEA诱导T细胞无能的体内外研究目的:建立T细胞无能的小鼠体内和体外模型,观察超抗原SEA反复刺激诱导无能T细胞的规律和特点。方法:①在体外,用MTT法测定间隔48h多次SEA刺激后的脾淋巴细胞的增殖反应;在体内,间隔不同天数反复注射SEA后,通过FACS检测脾淋巴细胞中CD3的表达。②通过FACS分析SEA反复刺激后,体内外淋巴细胞膜表型CD4、CD8、CD69和CD25的变化。③测定细胞培养上清或血清中细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10、)的水平,及细胞内IL-2和IL-10的阳性百分率。④在不同时间点,SEA再刺激体外或体内诱导的无能T细胞,通过MTT法的测定观察其反应性的恢复情况。结果:①经SEA初次刺激后的体内或体外培养的T细胞,对SEA的再刺激仍显示有继续增殖的能力。在体外,刺激T细胞第二次增殖的SEA最佳浓度为100ng/ml。与SEA初次刺激相比,细胞膜表型CD8表达上升的幅度显著高于CD4,CD69的表达没有明显上升,但仍保持在较高的水平;细胞因子IL-4和IL-10的含量均显著升高。在体内,间隔不同的天数,SEA体内第二次注射均可引起CD3表达升高。间隔3天组中,SEA的再注射主要促进了CD4表达的上升;间隔28天组中CD4和CD8的表达均有上升,且趋势相近。与SEA初次注射相比,血清及细胞内IL-2的水平仍有小幅度的递增,IL-10水平则显著上升。体内外,连续两次SEA刺激均能导致CD25不同程度的表达升高。②在体外,T细胞受间隔48h连续三次SEA刺激后,无明显的增殖反应;CD4和CD8的表达没有继续上升;CD69的表达显著下降;而CD25的表达在末次刺激后48h内保持在较高的水平。在体内,间隔不同天数的SEA连续三次注射后,小鼠脾淋巴细胞中CD3的表达均有不同程度的下降。各组中CD8的表达水平基本相似,CD4和CD25却有明显的不同:间隔3天组中,CD4的表达在末次注射后3天内明显降低;CD25没有上升的趋势,但在末次注射后3天内仍保持一定水平的表达。间隔28天组中,CD4的表达较稳定,没有显著的升降;CD25的表达水平较低。体内外均发现,经SEA多次刺激后,仅IL-10的水平仍继续上升。③体外培养的无能T细胞在7天内几乎没有增殖能力,21天后增殖能力显著提高,接近正常水平。在体内,间隔3天组和间隔28天组中诱导的无能T细胞分别从末次注射后第21天和第28天开始出现较弱的应答反应。结论:①首次在C57BL/6小鼠体内外成功建立了无能T细胞模型。但体内外诱导的无能T细胞经过一段时间的休息,其应答反应是可以逐渐恢复的。②经SEA初次刺激的T细胞,对SEA的再刺激,仍具有潜在的增殖反应。在体外,SEA的第二次刺激主要促进CD8亚群的增殖;在体内,首次证实间隔较短时间的连续两次SEA注射主要促进了CD4亚群的增殖,而间隔较长时间的两次SEA注射则对CD4和CD8亚群产生相似的增殖效果。③在体内实验中,首次证实了注射间隔时间的长短与无能的触发无关,但影响了CD4亚群的克隆清除,即间隔时间越短,被清除的CD4+T细胞越多;间隔时间越长,CD4+T细胞清除的程度越小。④在体内试验中发现,尽管CD25的高表达与无能的诱导密切相关,但不是绝对的,即在CD25低表达的情况下也可触发T细胞无能,并且CD25可能不参与无能状态的维持。⑤体内外试验均证实IL-10水平的升高与诱导T细胞无能密切相关,还可能与无能T细胞的维持有关。3.超抗原SEA诱导小鼠体内外T细胞无能过程中CD28/CTLA-4的变化目的:在超抗原SEA诱导小鼠体内外T细胞无能的过程中,观察CD28和CTLA-4变化规律及相互关系。方法:SEA体内或体外单次或多次刺激小鼠脾淋巴细胞后,通过FACS检测细胞膜表面CD28和CD152(CTLA-4)阳性表达率,及胞内CTLA-4的表达。结果:体外和体内的结果相似:SEA初次刺激后,CD28的表达显著上升;而CTLA-4在胞内和膜表面的表达均低。SEA再次刺激后,CD28的表达继续上升;CTLA-4的表达明显增加,胞内CTLA-4的升高尤为显著。SEA连续三次刺激后,CD28的表达显著降低;CTLA-4在膜表面和胞内的表达均开始下降。结论:CTLA-4的负调节作用限制了CD28的表达,抑制T细胞的继续活化,有利于无能的诱导;但CTLA-4在SEA反复刺激后的表达下调,提示其可能不参与无能T细胞的维持。上述研究显示,超抗原SEA诱导的机体免疫反应是一个有规律的变化过程,在肿瘤免疫治疗中犹如一把双刃剑,当人们正确掌握了它的合适剂量、给药间隔时间以及给药方式的规律,应该说SEA仍然是当前抗肿瘤的一个有力武器。