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特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF）是临床上最常见的间质性肺疾病。IPF病因不明,发病年龄多在60岁以上,是一种典型的衰老相关性疾病,病变局限在肺脏,临床表现为进行性呼吸困难并伴有肺实质的间质性浸润及限制性肺通气障碍。以普通型间质性肺炎（Usual Interstitial Pneumonia,UIP）的病理学特性为特征,即过多的细胞外基质沉积和肺组织结构破坏,正常肺组织散布在纤维化、蜂窝肺、成纤维细胞灶之间。影像学可显示明显的纤维化线条、网纹、蜂窝等,常伴有牵拉性支气管扩张。目前认为,衰老过程中的氧化损伤是IPF的发病诱因之一。近年来大量的临床观察发现IPF患者的气道及支气管肺泡灌洗液中氧化应激标志物呈现明显升高。研究提示,肺泡上皮细胞（Alveolar Epithelial Cells,AECs）的氧化损伤/凋亡可能是引发IPF发生的初始事件,并在疾病的发生发展中起到重要作用。氧化应激可使组织细胞活性氧类物质,如ROS（Reactive oxygen species）产生过多,ROS可直接损伤多种生物大分子如DNA等。为保证基因组DNA完整性,机体细胞进化发展了多种生化修复途径来应对DNA的氧化损伤。碱基切除修复系统（base excision repair system,BER）是最主要的DNA损伤修复系统之一。MUTYH（human Mut Y homolog,MUTYH）作为主要的BER修复基因,负责切除DNA复制过程中与氧化损伤产物8-羟基鸟嘌呤（8-oxoguanine,8-oxo-G）错配的A碱基。本实验室前期工作发现,中国人群中MUTYH基因存在Alu Yb8插入多态性变异,该插入变异可导致IPF患者体细胞线粒体基因组（Mitochondrial DNA,mt DNA）稳定性降低,并影响IPF的临床发展和预后。鉴于碱基切除修复基因及衰老在机体氧化应激中的关键作用,结合本实验室前期的研究结果,本论文将重点探讨MUTYH基因及衰老在IPF发生发展中的作用。第一部分:MUTYH基因缺陷在肺纤维化发生发展中的作用IPF的发生率随年龄的增长而显著增加,这与年龄相关的DNA氧化损伤累积有关。8-oxo-G是最主要的DNA氧化损伤产物,可引起线粒体功能障碍及多器官损伤。8-oxo-G是导致基因组DNA从G:C诱导突变为T:A的主要原因。生理条件下,机体可通过BER系统纠正该类突变,该系统中OGG1基因（oxoguanine glycosylase 1,OGG1）可去除DNA中鸟嘌呤氧化产生的8-oxo-G,而MUTYH可剪切模板DNA中与8-oxo-G中配对的腺嘌呤,避免DNA复制时由于8-oxo-G的存在而可能产生的G→T突变。可见BER系统对于维持DNA复制的保真性至关重要。我们实验室前期研究发现的MUTYH中Alu Yb8（Alu Yb8MUTYH）插入突变可损害IPF患者mt DNA的稳定性,且和IPF发病年龄相关。本研究我们使用Mutyh基因敲除小鼠和博莱霉素（Bleomycin,BLM）诱导的肺纤维化模型来检测Mutyh基因缺陷对肺纤维化进展的影响。令人意外的是,我们发现在Mutyh基因敲除小鼠中观察到的肺纤维化严重程度明显低于Mutyh野生型小鼠,组织纤维化及上皮标记物如TGF-β1、α-SMA、Vimentin和E-cadherin等关键蛋白的Western blot结果也支持了上述表型。与此同时,我们观察到Mutyh基因缺陷可阻止肺组织细胞中博莱霉素暴露关联的DNA单链断裂（Single Strand Breaks,SSBs）积累,并有助于维持组织mt DNA的完整性。此外,我们发现Mutyh基因缺陷还可在博莱霉素诱导的小鼠肺组织中维持线粒体动态平衡,并明显减少肺泡上皮细胞凋亡。基于上述研究结果,我们认为在严重的氧化应激背景下,MUTYH基因缺陷反而可减轻外界刺激物对肺组织的损害,这为我们理解MUTYH基因异常在不同条件下的表型作用复杂性提供了实验依据。第二部分:衰老相关肺纤维化易感分子的初步研究IPF发病机制尚未完全阐明,现有研究假说提示:机体随着年龄的增长,细胞氧化损伤修复功能逐渐减弱、DNA损伤逐步积累,在此背景下,如受到环境刺激,即可导致衰老相关性肺纤维化的发生。实验室前期利用D-半乳糖（D-galactose,D-Gal）成功构建了衰老小鼠模型,本部分研究我们以衰老小鼠为模型,采用相对低剂量的博莱霉素构建衰老相关性肺纤维化模型,观察衰老背景下小鼠肺纤维化发生发展的特点,同时探讨线粒体应激相关的调控机制在衰老性肺纤维化发生发展中的作用。结果显示:衰老或低浓度BLM的单独干预均可引起肺泡间隔轻微的胶原沉积;衰老的基础上再给予BLM可明显加重肺纤维化的表型。QPCR及Western blot结果提示衰老和BLM可交互促进小鼠肺组织中TGF-β1/Smad信号通路的激活。同时,我们还发现D-Gal可浓度依赖性的激活线粒体非折叠蛋白应答(mitochondrial unfolded protein response,UPRmt)关键基因mt Hsp70、Hsp60、Hsp10的表达,揭示衰老可激活UPRmt以代偿正常的线粒体功能。在衰老的基础上若再给予低浓度BLM刺激时,我们观察到mt Hsp70、Hsp60、Hsp10等UPRmt关联蛋白反而明显降低,线粒体融合蛋白MFN2表达增加,分裂蛋白Fis1表达降低,反映线粒体功能稳态的MTCO1/SDHA蛋白比例失调。结果表明在衰老的基础上给予外源性氧化应激刺激可使UPRmt失代偿,线粒体动力学及蛋白失衡,加重肺纤维化表型。基于以上实验研究,我们证实了衰老和外源性氧化应激刺激可相互作用,促进肺组织细胞发生氧化损伤,使mt Hsp70等分子伴侣蛋白表达失调,导致UPRmt呈失代偿状态,进而激活TGF-β1/Smad信号通路,加重小鼠肺纤维化表型。