目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)重要的慢性微血管并发症之一。长期高血糖及其引起的代谢紊乱,激活多种途径导致肾脏结构的不可逆改变,是终末期肾病的主要原因。主要病理特征为肾小球硬化、基底膜增厚及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积等。目前DN的发病机制尚未完全明确。色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF)是近年来发现的一种强有力的新生血管抑制因子,具有神经营养保护、调节血管通透性和高效抑制血管生成等作用。在DN的发生和发展过程中,常伴有ECM的合成和/或降解异常,而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在ECM代谢中起重要作用。按作用底物可将MMPs分为五类,MMP-2属于白明胶酶,在肾小球系膜细胞、内皮细胞、成纤维细胞等均有表达,主要降解Ⅳ型胶原。MMP-2的表达及活性改变可能参与了DN的发生发展。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在DN时过量表达,通过促进肾小球细胞增殖、肥大,导致ECM堆积,损伤滤过屏障,同时抑制MMPs的合成,减少ECM的降解,加速DN的形成。冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc是一种富含多糖、氨基酸、脂肪酸、甘露醇及多种微量元素的名贵中药。研究显示它可通过降低炎症反应、抑制肾小球系膜细胞增殖等多种途径起到肾脏保护作用。罗格列酮(rosiglitazone, RSG)作为噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂,通过结合并激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)发挥作用,具有降糖、抗炎、调节脂质代谢、抑制细胞生长因子及降低尿蛋白排泄等重要作用。因此,本研究通过腹腔注射大剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)建立1型糖尿病大鼠模型,并应用人工发酵虫草菌丝体干粉和RSG进行干预治疗,运用生物化学、病理形态学等方法检测肾脏形态及功能的改变和PEDF、MMP-2及TGF-β1在肾脏表达情况,探讨PEDF和MMP-2在糖尿病肾损害中的作用和人工发酵虫草菌丝体干粉及RSG在其中发挥的保护作用。方法:雄性8周龄SD大鼠60只,随机抽取15只作为正常对照组(A组),其余45只作为实验组。将实验组大鼠给予STZ 55mg/kg腹腔注射,72小时后测尾尖血糖大于16.7 mmol/L,持续3天,确认为1型糖尿病动物模型。把成模DM大鼠随机分为糖尿病对照组(B组)、人工发酵虫草菌丝体干粉2.4g/kg/d干预治疗组(C组)、RSG 4mg/kg/d干预治疗组(D组)。实验全程共持续12周,造模前及成模后0、4、8、12周末测量大鼠体重、血糖。第12周末实验结束前,代谢笼收集24小时尿液。股静脉放血处死动物,收集血液分离血清,测定血中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、谷丙转氨酶(ALT)、肾重指数(KWI)和24小时尿白蛋白排泄量(UAE)。肾组织制备光镜切片,运用HE、PAS染色方法观测肾脏形态学变化;用免疫组织化学方法检测PEDF、MMP-2和TGF-β1在肾组织的表达水平及部位;以逆转录PCR方法检测肾脏PEDF mRNA的表达情况。使用SPSS13.0统计软件处理实验数据,多组间比较采用方差分析,两组间比较采用LSD检验,等级资料采用秩和检验。结果:1造模72小时后,B组、C组和D组都较A组大鼠血糖明显升高,差异有显著性(P均<0.01),血糖均超过16.7 mmol/L,表明已成功建立1型糖尿病大鼠模型。4周、8周、12周末,B组、C组和D组血糖均高于A组,且差异有显著性(P均<0.01)。2造模72小时后及4周、8周及12周末实验结束时,B组、C组和D组都较A组大鼠体重明显降低,差异有显著性(P均<0.01)。B组、C组和D组肾重指数均较A组升高,差异具有显著性(P均<0.01),C组和D组肾重指数均较B组有所改善。3 12周末实验结束时,B、C、D组UAE较A组升高,差异具有显著性(P均<0.01)。C、D组UAE较B组有所降低,差异具有显著性(P均<0.01)。4 B、C、D组血清TG、TC与A组相比均升高,且有显著性差异(P均<0.01);C组TG、TC与B组相比降低,且有显著性差异(P均<0.01);D组TG与B组相比降低,有显著性差异(P<0.01),而TC无显著性差异(P>0.05)。B、C、D组血清Scr、BUN、ALT与A组相比均升高,且有显著性差异(P<0.01, P<0.01, P<0.01; P<0.05, P<0.01, P<0.01; P<0.01, P<0.01, P<0.01);C、D组血清Scr、BUN与B组相比降低,且有显著性差异(P均<0.01),而ALT无显著性差异(P>0.05)。5血清PEDF、TGF-β1水平测定结果显示,与A组相比,B、C、D组PEDF、TGF-β1水平较A组升高(P均<0.05);与B组相比,C、D组PEDF、TGF-β1水平降低,差异具有显著性(P均<0.05)。6 HE及PAS染色结果显示,与A组比较,B组肾小球肥大,基底膜增厚,系膜区基质明显增生,细胞增生。少数肾小球出现轻度硬化,部分肾小管呈空泡变性。C、D组较B组有所改善。7免疫组织化学分析结果显示,与A组相比,B组PEDF、MMP-2表达明显下降,阳性细胞的染色强度和分布范围之和明显降低且有显著性差异(P均<0.05),而TGF-β1表达上升(P<0.05)。C、D组PEDF、MMP-2表达较B组有所上升(P均<0.05),TGF-β1表达较B组降低(P<0.05)。8逆转录PCR反应结果显示,与A组比较,B、C、D组PEDF mRNA表达明显降低(P<0.01, P<0.05, P<0.05),经人工发酵虫草菌丝体干粉及RSG干预后,C、D组PEDF mRNA表达较B组有所上调(P均<0.01)。结论:1大鼠经腹腔一次性注射大剂量STZ,可建立1型糖尿病大鼠模型。该模型具有持续高血糖、尿量增加、体重减轻等明显的DM症状,与人类1型糖尿病的临床特征类似。故此模型可用于1型糖尿病慢性并发症的研究。2随着高血糖持续存在,DM大鼠肾脏出现不可逆损害,病理结构破坏,肾功能下降。形态学和实验室检查均符合糖尿病肾损害改变。糖代谢的异常对脂代谢及肝功能产生了一定的影响,共同对机体产生不利影响。3 DM大鼠肾脏组织PEDF、MMP-2及TGF-β1之间可能存在一定的相互作用,三者表达水平的改变可能促进了糖尿病肾损害的病程进展。4 DM大鼠血清PEDF、TGF-β1含量升高,提示肾脏病变过程中,循环中PEDF水平可能通过其他途径代偿性升高,与TGF-β1相互作用。5经人工发酵虫草菌丝体干粉和RSG干预后,DM大鼠肾脏功能及病理改变均明显改善,表明其可能通过改善肾功能、减少尿白蛋白排泄、调节血脂、调节PEDF、MMP-2和TGF-β1的蛋白表达,发挥明显的肾脏保护作用。