论文部分内容阅读
目的：研究人白血相关蛋白16（Leukemia Related Protein16，LRP16）因与核因子-κB（Nuclear Factor-κB，NF-κB）炎症通路的关系以对3T3-L1脂细胞葡萄糖代谢和胰岛素信号转导通路的影响，讨LRP16因对3T3-L1脂细胞胰岛素敏感的影响其可能的分子制。方法：（1）利用脂质体转染技构建过表LRP16因的3T3-L1前脂肪细胞系3T3-L1-LRP16其对照细胞系3T3-L1-3.1，按常规法培养诱导分化成熟，干预组加100μM的NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨甲酸(Pyrrolidine Dithiocarbamate，PDTC)孵育24小时（对照组加DMSO），用100nM胰岛素激30分钟。2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖法检测过表LRP16对3T3-L1脂细胞胰岛素激状态下葡萄糖取率的影响；Western Blot法检测上细胞中过表LRP16因对胰岛素受体物-1（Insulin ReceptorSubstrate, IRS-1）信号通路中的关键蛋白pIRS-1(Ser307)、pIRS-1(Tyr1179)、PI3-K(p85)、pAkt(Ser473)、pAkt(Thr308)表的影响。（2）分别提取成熟的3T3-L1-LRP163T3-L1-3.1脂细胞的蛋白和核蛋白，应用Western Blot法检测NF-κB p65的表，予上PDTC干预和胰岛素激，免疫荧光法检测其NF-κB p65蛋白的细胞内分布以了核转位情况。凝电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA) Supershift实验检测3T3-L1-LRP163T3-L1-3.1脂细胞的NF-κB p65的DNA活。将pNF-κB-Luc、pcDNA-3.1、pcDNA-3.1-LRP16、pRL-TK质粒共转染Hela细胞，双荧光素酶报告检测系统检测NF-κB-Luc相对荧光素酶活以反映NF-κB的转录活；用PDTC预孵育细胞24小时作为干预，复共转染实验。（3）实时荧光定量PCR法检测成熟3T3-L1-LRP163T3-L1-3.1脂细胞炎症细胞因子瘤坏因子α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6, IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）的mRNA表达，ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白的水平。结果：（1）过表LRP16抑制3T3-L1脂细胞胰岛素激的葡萄糖取，上调pIRS-1(Ser307)蛋白的表，下调pIRS-1(Tyr1179)、PI3-K(p85)、pAkt(Ser473)、pAkt(Thr308)蛋白的表， PDTC干预处理可改善上LRP16对葡萄糖取IRS-1信号通路的抑制效应。（2）过表LRP16增强3T3-L1脂细胞NF-κB p65核蛋白的DNA活，促进NF-κB p65蛋白的核转位，增加NF-κB p65的核蛋白表。LRP16剂量依赖增加Hela细胞NF-κB的转录活，PDTC干预处理可以抑制LRP16对NF-κB p65的核蛋白水平、核转位、DNA活和转录活的增强效应。（3）过表LRP16因显著增加了脂细胞炎症因子的表：3T3-L1-LRP16细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的表水平分别是对照3T3-L1-3.1细胞的4.53、7.17、9.58倍(P<0.05)，3T3-L1-LRP16细胞培养上清中的TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白浓度分别是对照3T3-L1-3.1细胞的1.54、1.78、2.13倍(P<0.05)。结论：LRP16通过增强NF-κB转录、增加NF-κBp65的DNA活、促进NF-κB核转位激活了NF-κB炎症通路，促进了脂细胞炎症因子的表，干扰了IRS-1信号通路，导致3T3-L1脂细胞胰岛素抗。