小麦DNA甲基化靶向捕获探针设计及种子胚发育甲基化分析

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小麦(Triticum aestivum L.)作为世界上最重要的粮食作物之一,具有广泛的适应性,全世界超过40%的人口以小麦作为主食。小麦种子承载着大量遗传信息,种子中胚的发育和萌发过程对器官再生起重要作用。表观遗传学修饰(Epigenetics modification)在植物的胚生长发育中起到了重要的作用,其中,DNA甲基化(DNA methylation)是最早发现也是最为常见的表观遗传修饰之一。但是,因小麦基因组庞大且复杂,一直缺少经济高效的小麦DNA甲基化鉴定方法。本研究根据小麦中国春(Chinese Spring)1.0基因组序列预测并筛选富含DNA甲基化的Cp G岛区域,结合公共转录组数据,通过罗氏平台设计DNA甲基化靶向捕获探针,对开花后发育12、16、20、24天(DPA12-24)的胚DNA甲基化水平进行分析,在评价靶向捕获探针进行小麦DNA甲基化研究效率的基础上,探究小麦胚发育过程中DNA甲基化变化。主要研究结果如下:1.基于普通小麦中国春1.0基因组预测到Cp G岛(CGI)数量1800233个,其中A基因组626026个、B基因组585607个、D基因组526850个。结合NCBI等公共数据库中春小麦不同组织、不同时期的转录组数据与CGI数据设计探针299596个,与罗氏公司合作完成Seq Cap Epi Developer Probes设计与探针定制。利用所开发的CGI探针,通过Seq Cap Epi System对小麦花后12、16、20、24天(DPA12-DPA24)胚进行DNA甲基化建库、测序,获得269.9×10~6reads数据。测序结果通过Bismark软件比对,筛选符合条件的比对序列评估探针捕获效率。以探针拟捕获区段为参考,平均比对效率为0.11%,捕获测序所得reads多数未在设计区域附近,探针捕获效率较低。以中国春2.0基因组为参考,平均比对率提升至62.5%,平均比对效率提升为30.26%,存在大量重复序列,推测与设计序列的复杂性和探针制作方法有关。进一步分析发现捕获的reads有90%在小麦基因组转座子上,不到10%在基因间区。4个样品reads平均GC含量44.74%,无高GC含量的特征。2.通过Bat Meth2软件对捕获的DNA甲基化位点及区域的甲基化水平进行计算,检测差异甲基化胞嘧啶位点及区域。结果显示,所捕获的区域主要在转座子和基因间区并呈现出高甲基化状态。筛选小麦花后4个时间点捕获的20.9万个共有胞嘧啶位点进行甲基化分析,胞嘧啶甲基化以Cp G甲基化占比最高为61%,CHG甲基化占比居中为23%,CHH甲基化占比最低为16%。小麦胚DPA12到DPA16的甲基化水平有略微增高的趋势:Cp G甲基化并没有太大差异变化且呈高甲基化状态,CHG甲基化水平有略微增高的趋势,CHH甲基化有明显增高趋势,在DPA24达到最高。以小麦胚DPA12为对照,比较不同发育时期差异甲基化位点(DMC)和差异甲基化区域(DMR),在DPA16、DPA20、DPA24样品中,分别鉴定到DMC72个、26个、75个,以及DMR4个、1个、4个。DPA16与DPA24存在3个共同的DMR,3个DMR的甲基化程度从DPA12的平均76.2%降低到DPA24的0%,推测3个区段均存在去甲基化过程。
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