补体是免疫系统重要的组成部分,在维持机体内环境稳定和抗感染免疫等方面发挥着十分重要的作用。在生理情况下,补体成分是以无活性的酶前体形式存在的,在某些启动因素影响下可被依次活化产生级联放大效应而发挥作用。目前,有关补体与肠炎、肿瘤关系的研究较多,在与肠炎关系的研究中发现,补体存在时炎症会加重,而补体缺失炎症则会减轻,这证实补体能促进肠炎的发展;但在与肿瘤关系的研究中,情况却较为复杂,部分实验结果证实补体能抑制肿瘤的生长,而另一些实验结果则发现补体能促进肿瘤的发生、发展。溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种病因不明、病程周期长的慢性肠道炎症性疾病,由于缺乏有效治疗,病情常迁延不愈。溃疡性结肠炎最严重的并发症是肠炎相关性结直肠癌(Colitis-associated colorectal cancer,CAC),随着患病时间的延长,溃疡性结肠炎癌变的几率逐步增高,据统计,约有15%患者死于癌变。补体与肠炎、肠道肿瘤的发生均相关,但在肠炎向肠癌转变过程中的作用,目前国内外却鲜有报道。在这一过程中,补体是否起作用、起着什么样的作用、作用的机制如何,均是值得探讨的问题。目的 探讨补体在UC癌变中的作用及机制,为将来可能的临床应用提供理论和实验依据。方法 1.以氧化偶氮甲烷(azoxymethane, AOM)和葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)联用的方法建立CAC小鼠模型：AOM单次腹腔注射,剂量为10mg/kg/只；5天后予以DSS溶液口服,浓度为1.5%,连服7天,然后换服清水14天,总计21天为一个周期,共三周期。单用DSS建立急性肠炎小鼠模型：予以DSS溶液口服,浓度3%,连服5天,然后换服清水5天。2.分别在建模的第0天、20天、40天、60天和第100天检测小鼠补体活化的指标：用定量聚合酶链反应(Quantitativepolymerase chain reaction,qPCR)检测小鼠肠道匀浆中C3、C5、C3aR、C5aR的mRNA表达水平；用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测小鼠肠培养上清C3a、C5a的表达水平；用免疫组化的方法检测小鼠肠道补体的水平。3.观察活化补体在小鼠CAC模型中的作用：用肠道肿瘤计数及病理细胞学方法对比观察补体缺失小鼠CAC模型(C3、C5、C5aR敲除)和野生型小鼠成瘤率的差异。4.明确补体在UC癌变中的作用机制：用病理细胞学、免疫组化及荧光激活细胞分选系统(Fluorescence activated cell sorting, FACS)检测肠道细胞浸润情况,同时检测急性肠炎模型的肠道通透性和菌群移位情况,明确浸润细胞与肠道通透性、肠道菌群移位的关系；qPCR、ELISA检测肠道浸润的细胞群所表达的细胞因子,同时通过体内外实验明确细胞群之间、细胞因子之间的关系以及它们与补体的关系；用免疫组化及western blotting检测CAC模型肠道上皮增殖、凋亡情况及相关的信号通路,并明确它们和细胞因子之间的关系。结果1.无论是在急性模型还是在慢性模型的建模过程中,小鼠均出现了腹泻、便血、体重下降等肠炎症状,建模结束后的肠道病理显示：急性肠炎小鼠肠道明显充血、水肿,肠上皮可见糜烂、溃疡病灶,并有大量的炎性细胞浸润；CAC模型小鼠除上述改变外,还可见肠道有多个结节状肿瘤,镜下观察细胞异型增生明显,核浆比失调,腺管排列紊乱,肠上皮正常组织结构被破坏,提示建模成功。2.与对照组相比,模型小鼠从建模20天起就出现了补体C3、C5、C3aR、 C5aR及补体活化产物C3a、C5a的表达升高,在建模40天、60天及100天时,上述指标逐步升高。仅C5a的表达水平在20天、40天时升高,其后降低,这是因为当C5a过度表达时,会和细胞膜表面的C5aR结合而被转入到细胞内导致其胞外浓度减低,即C5a的内化作用。这些结果显示,在UC癌变的过程中,补体是持续活化的,且活化水平逐步增高。3.与野生型小鼠相比,无论是补体C3、C5还是C5aR缺失的小鼠,其成瘤率都明显减低,提示在UC癌变过程中,补体不仅持续活化,且活化的补体发挥了促进肿瘤发生和发展的作用。4.与野生型CAC小鼠相比,补体缺失小鼠CAC模型中的肠道白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素17A(Interleukin-17 A,IL-17A)和白细胞介素22(Interleukin-22,IL-22)水平显著降低,而一些常见的与肠炎、肠癌发展关系密切的因子如白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子a(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、干扰素γ(Interferon gamma,IFNγ)等却没有明显的变化,提示在UC癌变的过程中,活化补体主要是通过调节IL-1β、IL-17A和IL-22的表达水平而影响了肿瘤的发生。同时,补体缺失的小鼠模型肠道中的中性粒细胞浸润显著减少；在通常情况下,中性粒细胞聚集的最大诱因是细菌及其代谢产物,而在肠道中存在着大量的菌群,那中性粒细胞的聚集是否和这些菌群相关呢?由于正常肠道粘膜有屏障作用,菌群不能进入肠上皮层中,补体是否通过影响肠道通透性进而导致肠道菌群移位而引起了中性粒细胞的聚集呢?通过检测急性肠炎模型发现,与正常小鼠相比,无论补体缺失与否,急性肠炎模型的肠道通透性都是明显增加的,肠道菌群移位也是存在的,但补体缺失的急性肠炎模型和野生型急性肠炎模型相比,肠道通透性和肠道菌群移位却没有差异,提示补体不是通过这条途径引起中性粒细胞浸润的。进一步的检测发现,中性粒细胞表达C5aR,可与C5a相结合,而C5a的趋化作用及免疫调节作用均是过敏毒素中最强的,说明活化补体是通过C5a引起了中性粒细胞在肠道的聚集。肠上皮qPCR、ELISA的结果显示,IL-1β主要是由肠道中性粒细胞表达的,而当补体缺失时不仅浸润的中性粒细胞数量明显减少,其表达IL-1β的能力也明显下降；IL-17A则主要是由肠道CDllb+的髓系细胞表达的,当补体缺失时,这群细胞的数量也是明显减低的,表达IL-17A的能力也明显减弱。体外实验发现,用IL-1β刺激髓系细胞,能上调IL-17A的表达,而阻断了IL-1β的作用后,IL-17A的表达下降；将不同来源的中性粒细胞与髓系细胞共孵育,发现野生型CAC模型鼠的中性粒细胞能明显促进髓系细胞上调IL-17A的表达,而补体缺失CAC模型鼠中性粒细胞的刺激效果较差；体内试验中,分别在CAC模型中敲低[用白细胞介素-1受体拮抗剂(Interleuekin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)模拟敲低的效果]和过表达IL-1p来检测IL-17A的表达水平,结果发现,敲低了IL-1β后,IL-17A的表达水平明显减低,而过表达IL-1β后,IL-17A的水平明显升高。这些结果都提示：在UC癌变过程中,IL-1β调节了IL-17A的表达,结合前面的实验结果,说明活化补体能通过中性粒细胞分泌IL-1β来调节髓系细胞表达IL-17A的水平,即存在着IL-1β/IL-17A调节轴。用IL-17A刺激肠肿瘤细胞系CT26,发现它能促进细胞增殖,且其作用与IL-17A浓度呈正相关。免疫组化及western blotting的结果显示：当补体缺失时,肠上皮信号传导与转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,stat3)和核转录因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)p65磷酸化水平明显减低,进而引起CAC模型鼠肠道上皮凋亡增加,增殖减弱,提示补体最终是通过这两个信号通路导致了UC的癌变。结论 活化补体促进了UC癌变,其机制是：活化的补体通过活化产物如C5a引起了肠道上皮中性粒细胞聚集并大量分泌IL-1p,IL-1p刺激肠道上皮浸润的髓系细胞上调1 L-17A的表达,进而激活stat3和NF-κB p65信号磷酸化水平导致了肠癌的发生和发展。即活化补体通过肠道IL-1β/IL-17A调节轴促进了Uc癌变。