富马酸是迄今发现的最简单的不饱和二元羧酸,其结构中的不饱和双键以及两个羧基奠定了被衍生化和功能化的基础,具有较大的应用潜力。随着石油价格的上涨以及环境污染等问题,化学法产富马酸的劣势日益凸显。可再生生物质发酵生产富马酸以其条件温和,环境友好,副产物种类少等优势逐渐受到人们的关注,成为最具开发潜力的富马酸生产方法。高效利用木质纤维素发酵生产富马酸是本论文的主要研究内容。论文从木糖的高效利用出发,开发了少根根霉菌发酵木质纤维素水解液产富马酸的生产工艺;根据根霉菌、解脂耶罗氏酵母等微生物发酵过程受碳氮比调控的现象,以解脂耶罗氏酵母为出发菌株,从关键基因表达强度的角度分析了碳氮比调控基因表达的过程。本论文的具体内容为:1.高效利用木糖根霉菌菌种的筛选以及葡萄糖-木糖共发酵过程的研究。以高浓度木糖对少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)RH7-13进行了压力筛选,得到的新菌株RH 7-13-9#,固定化新菌株发酵80 g/L木糖,富马酸产量达45.31 g/L,较原始菌株产酸量提高了 1.7倍,木糖对富马酸的转化率提高至73%,高于目前文献报道的结果。新菌株对葡萄糖也具有较好的利用效果,富马酸产量可达到37.52 g/L,以此为基础开发了葡萄糖-木糖共发酵工艺,葡萄糖与木糖添加比为75%:25%、碳氮比为800:1时富马酸产量最高达到46.78 g/L,较葡萄糖单独为碳源时的产酸量提高25%,为进一步利用木质纤维水解液奠定了基础。2.少根根霉菌利用木质纤维素水解液发酵产富马酸的过程优化。采用传统的酸水解法处理酿酒发酵剩余的稻壳麦麸残渣,得到了木质纤维素水解液。以脱毒后的水解液为碳源,根霉菌RH 7-13-9#生长状况较好,富马酸产量可达21.03 g/L;加入一定量的葡萄糖与木糖调整脱毒水解液中总单糖量为80 g/L,葡萄糖与木糖比例为75%:25%时,富马酸产量达到30.13 g/L,表明脱毒处理后的木质纤维素水解液能够直接用于根霉菌发酵产富马酸。在利用未脱毒水解液的过程中,用KOH调节未脱毒水解液pH至4.7后可直接用于RH 7-13-9#菌种的培养,但培养的菌体富马酸积累能力较差,乙醇产量较高。以浓缩的未脱毒水解液作为培养基时,乙醇产量达到16.26 g/L,时空产率为1.36 g/L·h,与报道的酿酒酵母发酵木质纤维素水解液产乙醇的时空产率相当。3.菌体固定化发酵产富马酸在搅拌式反应器内的放大工艺研究。通过对不同固定化载体的优化,确定大孔网状生物质材料(丝瓜瓤)为最佳载体,富马酸产量最高达到36.69 g/L,时空产率达到0.437 g/L·h。同时,菌体能够完全附着于载体上,解决了游离菌体发酵不耐受剪切力等问题。以此为基础,实现了连续批次发酵过程,平均富马酸浓度约为25.2 g/L,与单批次发酵过程相比,发酵时间缩短约50 h。采用该工艺,以脱毒的木质纤维素水解液替代部分碳源在搅拌式反应器内发酵产富马酸,产量最高达到25.03 g/L,证明了木质纤维素水解液可替代部分碳源用于有机酸的发酵。4.以亮氨酸缺陷型解脂耶罗氏酵母为出发菌株,探究碳氮比对基因表达过程的影响。以荧光素酶Nluc为报告基因,通过克隆解脂耶罗氏酵母积累油脂相关代谢途径中22个关键基因的启动子,构建表达质粒PYLXP’-Nluc,并在碳氮比10:1、50:1、100:1条件下从NADPH调控、碳骨架调控、脂质合成与降解以及TCA-乙醛酸循环调控四个模块分析了各个启动子的表达强度随时间的变化,其中ZWF1、GND2、MnDH1、MnDH2、MAE1、UGA2、PDC1、HXK1、FAS2、DGA1、POX4、IDH2、ICL1、UGA1、GAD共计15个基因的启动子表达强度随碳氮比升高而上调,该结果与已报道的代谢途径改造结果相互印证,证明了碳氮比可通过影响基因启动子表达强度来调控油脂的积累,为进一步研究碳氮比对根霉菌代谢过程的影响奠定了基础。