在法医学检案中经常遇到受害人在遭受持续捆绑或限制体位等应激情形后出现一定程度精神损伤的案件。由于此类精神损伤的分子机制尚不清楚,且缺乏客观的评判标准,使此类应激原与精神损伤之间的关系难以界定,常常导致案件久拖不决,给社会造成不良影响。因此,揭示此类应激原导致精神损伤的病理分子机制具有重要的法医学意义。杏仁核是参与情感、认知形成的脑区。毁损双侧杏仁核大鼠缺乏对恐惧事件的分辨能力。临床影像学研究发现重度抑郁和痴呆患者杏仁核体积会发生明显变化,提示杏仁核在控制恐惧情绪中发挥重要作用,并参与相关精神障碍的发生。胶质细胞占据了杏仁核细胞成分的1/2,在维持杏仁核正常功能方面发挥了重要作用。有研究显示星形胶质细胞凋亡与许多中枢神经损伤性及退行性病变密切相关。因此,探讨应激诱导杏仁核星形胶质细胞凋亡的机制对于揭示应激致精神损伤的分子机制具有重要意义。应激状态下,下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(Hypothalamic Pituitary adrenal Axis,HPA)激活,下丘脑室旁核合成和分泌促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin Releasing Hormone,CRH)增加,CRH到达腺垂体并通过一系列细胞内级联放大反应促使促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotrophic Hormone,ACTH)合成增多,ACTH到达肾上腺促进肾上腺皮质合成和分泌糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)增加。外周血GC水平持续升高是应激过程中非常重要的神经内分泌反应。在垂体、下丘脑、海马和前额叶皮质存在糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)和盐皮质激素受体(Mineralocorticoid receptor,MR),生理水平的GC透过血脑屏障通过与受体结合负反馈靶向约束神经内分泌系统的过度激活,但外周血GC水平持续增高则会产生神经毒性作用。此外细胞学实验证实,GC可以诱导海马神经元和杏仁核神经元凋亡。杏仁核内胶质细胞表面含有丰富的GC受体,增高的GC是否会透过血脑屏障作用于星形胶质细胞上的GC受体,诱导星形胶质细胞凋亡尚未见文献报道。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是近来在凋亡机制研究中发现的一条新的细胞凋亡信号传导通路,过度激活的ERS通路最终将引发细胞凋亡。许多神经损伤性和退行性疾病比如阿尔茨海默症、创伤后应激障碍(Post-traumatic stress disorder,PTSD)的发病机制均与ERS诱导的细胞凋亡有关。ERS是否参与GC诱导杏仁核星形胶质细胞凋亡尚未见文献报道。基于上述研究现状,我们提出如下假设:应激状态下高度分泌的GC将作用于杏仁核星形胶质细胞导致星形胶质细胞凋亡,而ERS在该过程中发挥了重要作用。本研究应用大鼠慢性束缚应激模型和体外培养人星形胶质细胞,从整体和细胞水平系统研究在应激反应中GC对星形胶质细胞的损伤作用,并对其ERS机制加以深入探讨,以期为应激相关的精神损伤鉴定提供理论依据。第一部分慢性束缚应激对大鼠杏仁核星形胶质细胞的损伤作用目的:通过建立大鼠慢性束缚应激模型,观察慢性束缚应激对大鼠杏仁核星形胶质细胞的损伤作用。方法:建立大鼠慢性束缚应激模型。实验分为正常对照组和慢性束缚应激组,慢性束缚应激组再次分为束缚1天组、7天组、14天组和21天组。监测各组大鼠体重及肾上腺重量的变化。应用高架十字迷宫实验观察大鼠行为学变化。ELISA法检测大鼠血清CRH、ACTH和GC浓度。应用免疫组化方法及Western blot方法检测杏仁核糖皮质激素受体GR和星形胶质细胞特异性标记蛋白GFAP表达的变化。透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察杏仁核胶质细胞的超微结构改变。流式细胞术AnnexinⅤ-PI双标染色法检测杏仁核胶质细胞凋亡率。结果:1大鼠体重的变化:正常对照组大鼠体重逐渐增加,慢性束缚应激组大鼠体重增加缓慢。2大鼠肾上腺的变化:与正常对照组大鼠相比,慢性束缚应激7d组、14d组、21d组大鼠肾上腺重量明显增加;光镜下肾上腺皮质显著增宽。3 ELISA法检测各组大鼠血清糖皮质激素浓度的改变:与正常对照组相比,慢性束缚应激7d、14d和21d组大鼠血清CRH水平明显升高,慢性束缚应激21d组大鼠血清ACTH水平明显升高,慢性束缚应激14d组、21d组大鼠血清GC水平显著升高(p<0.05)。4高架十字迷宫实验结果提示各组大鼠自发运动功能无差别。与正常对照组相比,慢性束缚应激7d组、14d组、21d组大鼠开臂停留时间百分比及进入开臂次数百分比显著减少。5免疫组化法检测糖皮质激素受体GR和星形胶质细胞标志性蛋白GFAP在大鼠杏仁核的表达:GR和GFAP的阳性信号均定位于胞浆,与正常对照组相比,慢性束缚应激14d组、21d组大鼠杏仁核GR表达逐渐增加;而GFAP在慢性束缚应激7d组、14d组、21d组杏仁核的表达明显降低。6 Western blot方法检测GR和GFAP在大鼠杏仁核的表达:与正常对照组相比,慢性束缚应激7d组、14d组、21d组大鼠杏仁核GR明显增加,而GFAP表达明显降低。7透射电镜观察杏仁核胶质细胞超微结构的改变:与正常对照组相比,慢性束缚应激1d组到21组杏仁核脑区呈现不同程度的胶质细胞损伤性变化,包括细胞水肿、核周裂增宽、线粒体嵴和膜融合、粗面内质网颗粒融合并脱颗粒、染色质边集、核固缩。8流式细胞术对大鼠杏仁核胶质细胞凋亡检测结果:与正常对照组相比,慢性束缚应激21d组杏仁核神经胶质细胞凋亡率显著增加。小结:本部分实验成功建立了大鼠慢性束缚应激损伤模型,模型大鼠出现明显的焦虑样行为学改变,杏仁核GFAP阳性星形胶质细胞数目显著减少,GR表达明显增加,杏仁核胶质细胞出现了凋亡性的超微结构改变,杏仁核胶质细胞凋亡率明显增加。第二部分糖皮质激素对慢性束缚应激大鼠杏仁核星形胶质细胞凋亡和内质网应激标志蛋白表达的影响目的:通过观察慢性束缚应激大鼠杏仁核星形胶质细胞凋亡现象及内质网应激标志性蛋白GRP78、CHOP和Caspase 12的表达,研究星形胶质细胞的凋亡机制。方法:实验分为4组,正常对照组(Con组),慢性束缚应激组(CRS组),GC受体拮抗剂组(RU486组,慢性束缚应激+RU486),溶剂对照组(propylene glycol组,慢性束缚应激+丙二醇)。应用高架十字迷宫实验观察大鼠行为学变化。采用免疫组化检测GFAP和S100β的表达;采用免疫组化和Western blot方法检测杏仁核星形胶质细胞标记物GFAP、S100β蛋白的表达,应用Western blot方法检测内质网应激标志分子GRP78、CHOP、Caspase 12蛋白的表达;流式细胞术AnnexinⅤ-PI双标染色法检测杏仁核胶质细胞凋亡率。结果:1与Con组相比,CRS组大鼠开臂停留时间百分比及进入开臂次数百分比显著减少;与CRS组相比,RU486组大鼠开臂停留时间百分比及进入开臂次数百分比明显增加;CRS组与propylene glycol组相比,两组无明显差别。各组大鼠自发运动功能无明显差别。2免疫组化法及Western blot法检测GFAP和S100β蛋白在大鼠杏仁核的表达:免疫组化结果显示,与Con组相比,CRS组大鼠杏仁核GFAP和S100β阳性细胞数目均明显减少;与CRS组相比,RU486组的GFAP和S100β阳性细胞数目增加,而CRS组与propylene glycol组相比无明显差别。Western blot检测结果趋势与免疫组化法相似,与Con组相比,CRS组大鼠杏仁核GFAP和S100β表达均明显减少;与CRS组相比,RU486组的GFAP和S100β表达增加,而CRS组与propylene glycol组相比无明显差别。3 Western blot法检测GRP78、CHOP、Caspase 12蛋白在大鼠杏仁核的表达:与Con组相比,CRS组大鼠杏仁核GRP78、CHOP、Caspase 12表达均明显增加;与CRS组相比,RU486组的GRP78、CHOP、Caspase12表达显著减少,而CRS组与propylene glycol组相比无明显差别。4流式细胞术AnnexinⅤ-PI双标染色法检测杏仁核细胞凋亡:与Con组相比,CRS组细胞凋亡率明显升高;与CRS组相比,RU486组的凋亡率明显下降;CRS组与propylene glycol组相比无明显差别。小结:GC可以诱导慢性束缚应激大鼠杏仁核星形胶质细胞凋亡,其作用机制与内质网应激有关。第三部分地塞米松诱导人星形胶质细胞凋亡的内质网应激机制目的:观察地塞米松(Dexamethasone,DEX)对人星形胶质细胞(Human astrocytes,HA)凋亡的影响,并对其内质网应激机制及通路进行深入探讨。方法:1培养人星形胶质细胞,免疫荧光法检测GR表达。2采用MTT实验检测不同浓度的DEX(10-9 M~10-5 M)对星形胶质细胞存活率的影响;3 Western blot方法检测检测GFAP、S100β、GRP78、CHOP、Caspase12的表达;采用Western blot方法检测p-PERK、p-e IF2α、ATF4蛋白表达情况。流式细胞术AnnexinⅤ-PI双标染色法检测细胞凋亡率。4观察CHOP敲低对DEX所致星形胶质细胞凋亡的影响。10-6M的DEX处理前给予CHOP siRNA,Western blot方法检测CHOP蛋白的表达以验证转染效率,流式细胞术AnnexinⅤ-PI双标染色法检测细胞凋亡率。结果:1 HA细胞GR的表达情况:HA细胞表达GR,阳性部位位于细胞浆。2与Con组相比,10-9 M~10-5 M的DEX作用HA细胞48 h后,细胞存活率明显降低。3与Con组相比,10-6 M的DEX作用于HA细胞6h后,细胞凋亡率明显升高,DEX+RU486组与DEX组相比凋亡率明显下降。单独应用RU486组与CON组相比无明显差别。4与Con组相比,DEX组GRP78、CHOP、Caspase 12的蛋白水平均明显增高;与DEX组相比DEX+RU486组上述蛋白表达下降。单独应用RU486组与Con组相比无明显差别。5与Con组相比,DEX组p-PERK、p-e IF2α、ATF4蛋白表达均明显增高,而与DEX组相比DEX+RU486组上述蛋白表达下降。单独应用RU486组与Con组相比无明显差别。6与DEX组相比,DEX+CHOP siRNA组CHOP蛋白表达明显减少,证明细胞转染成功。与DEX处理组相比,CHOP siRNA处理组细胞凋亡率明显下降,CHOP siRNA明显逆转了DEX诱导的星形胶质细胞凋亡;而control siRNA处理组与DEX组处理组相比无明显差别。小结:DEX可独立诱导人星形胶质细胞凋亡,抑制内质网应激CHOP途径可以抑制DEX诱导星形胶质细胞凋亡的发生,提示GC通过与受体结合,激活内质网应激p-PERK/p-e IF2α/ATF4/CHOP通路,诱导人星形胶质细胞凋亡。综上,本实验通过建立大鼠慢性束缚应激损伤模型和体外培养人星形胶质细胞,系统研究了糖皮质激素对星形胶质细胞的影响,证实糖皮质激素在束缚应激导致杏仁核星形胶质细胞损伤的过程中发挥了重要作用,内质网应激参与了这一过程。正确评价糖皮质激素在应激反应中的作用,可为应激所致精神损害的法医学鉴定和治疗提供一定的理论依据。