论文部分内容阅读
猪伪狂犬病的病原是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV),临床上以瘙痒、神经症状和繁殖障碍为特征,给养猪业造成了巨大的经济损失。经典疫苗株在防控该病中起到了重要作用,但前几年出现了免疫猪群发生伪狂犬病的现象,并在一定范围内造成流行,提示PRV可能出现变异。因此,研发基于PRV变异株的猪伪狂犬疫苗具有重要的实践意义。本文对江苏某猪场疑似发生伪狂犬病的病猪进行病毒分离,证实该病毒具有PRV变异株的序列特征。以所分离的PRV变异株为母本,构建了剔除报告基因的gE基因单缺失病毒株,并对该重组毒株的生长特性和免疫保护力开展进一步评估,该研究将为进一步研制伪狂犬病基因工程疫苗奠定基础。1.PRV变异株的分离鉴定及纯化对江苏某疑似发生猪伪狂犬病猪场的送检病料进行检测,通过PCR鉴定初步判断病猪为PRV感染,同时混合感染猪瘟病毒。将病料经过0.22μm滤膜过滤后接种至PK15细胞,28 h左右细胞开始产生皱缩变圆等典型的细胞病变,PCR检测同时含有PRV和猪瘟病毒。通过蛋白酶消化和苯酚抽提法提取病毒的总DNA,并采用磷酸钙转染PK15细胞的方法对病毒进行纯化,PCR检测仅含PRV。纯化后的病毒能够在PK15细胞上形成典型的细胞病变,在透射电镜下可以观察到明显的PRV粒子结构,进一步证实分离到的病毒是PRV。gE基因序列测定显示第48位和第492位各有1个天冬氨酸的插入,该突变是已报道PRV变异株特征性的序列变化。因此,所分离的毒株为变异株,命名为PRV-TX。2.PRV变异株gE基因缺失株的构建利用本实验室所构建的带有绿色荧光蛋白标记的pSKgERL-GFP转移载体质粒,通过蛋白酶消化和苯酚抽提法提取了 PRV-TX的基因组DNA,运用磷酸钙沉淀法,将细胞总DNA和转移载体以10 μg:1 μg的比例共转染PK15细胞,待细胞出现80%病变时收获病毒,倍比稀释后接种至单层的PK15细胞,通过空斑纯化法筛选得到带有报告基因的重组病毒。运用Cre重组酶敲除报告基因,经空斑纯化获得剔除报告基因的gE单缺失株rPRV-TX-gE-。3.PRV gE缺失株的生长特性及免疫效力研究在PK15细胞上生长曲线测定发现,gE单缺失株rPRV-TX-gE-生长曲线与亲本株PRV-TX 一致,培养84 h后缺失株和亲本株的滴度分别为106.14 TCIDs0/0.1 mL和106.34 TCID50/0.1mL,两者无显著性差异,表明gE基因的缺失对该病毒增殖无明显影响。在小鼠上进行LD50测定,同时选择经典株PRV-SZ及其gE单缺失株rPRV-SZ-gE-进行比较。结果显示PRV-SZ、rPRV-SZ-gE、PRV-TX、rPRV-TX-gE-对小鼠的LD50分别为103.67 TCIDs0/0.1mL、104TCIDs0/0.1mL、103.5TCID50/0.1mL和 104.17TCID50/0.1mL,该结果表明,经典株和变异株对小鼠致病性相似,与各自亲本株相比,两株gE单缺失株对小鼠的毒力均明显下降。分别将rPRV-SZ-gE-和rPRV-TX-gE-两株缺失株以103 TCIDso剂量采用肌肉注射方式免疫小鼠,免疫后21 d分别用PRV-SZ、PRV-TX以104TCID50攻毒,结果表明rPRV-TX-gE-缺失株疫苗免疫组对以上两种攻毒株能够产生83.3%的保护率,而rPRV-SZ-gE-缺失株免疫组对PRV-SZ的攻毒保护率为66.7%,而对PRV-TX攻毒保护率仅为33.3%。因此,rPRV-TX-gE-对于经典株和变异株的攻击均能提供一定的保护,而rPRV-SZ-gE-对于变异株的攻击提供的保护率较低。