生物质能是太阳能以化学能形式储存在生物质中的能量形式,是人类赖以生存的重要能源之一,是仅次于煤炭、石油、天然气之后的第四大能源。当前,由于生物质能的可再生性的和无污染性使得世界各国竞相开发研究生物质能源。目前,能源微生物的研究多停留在筛选野生菌株,也有极少部分利用基因工程技术来改造菌株使其对生物质有更高的降解效率。如把锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶等相关基因转入到毕赤酵母菌或者枯草芽孢杆菌等体内制成工程菌株,来降解植物的木质素。众所周知,不管是锰过氧化物酶,还是木质素过氧化物酶,都是通过改变细胞内的氧化还原状态来促使酶分解木质素、纤维素或者半纤维素。但是,还没有人尝试通过构建植物活性氧蛋白酶载体,把活性氧相关基因转入受体菌株,构成工程菌株降解生物质。本研究尝试了把植物活性氧蛋白酶基因构建载体转入筛选出的合适的野生菌株,成功构建了转基因菌株,并探索调控植物活性氧代谢的酶降解木质素、纤维素以及半纤维素的能力。首先,本研究以生物质如腐木、秸秆等为实验材料,采用愈创木酚法和表型分离法,筛选同降解纤维素、半纤维素或者木质素相关的潜在野生菌株。在该过程中,我们采集南阳师范学院东区校园、中区逸夫楼前花园、南阳市白河湿地公园和河南省淅川县荆紫关法海禅寺周围的原始森林等地的不同种类腐木,以及南阳市北郊七里园乡赵官庄村和白塔村的玉米秸秆为实验材料。实验分两组进行,一组以腐木为实验材料,采用愈创木酚法筛选同降解木质素相关的野生菌株;另一组以玉米秸秆为实验材料,根据生长在腐烂玉米秸秆上的菌群数量多少为筛选指标,分离潜在的降解玉米秸秆的野生菌株。根据愈创木酚法获得了3株可以使愈创木酚培养基产生显色反应且生长较为良好的菌株,通过分子鉴定为芽孢杆菌属细菌。由于在制取感受态和转化过程中没有现成的技术可以参考,转拟南芥活性氧代谢相关的转基因芽孢杆菌菌株一直没有成功。不过,在玉米秸秆降解菌的筛选过程中,我们获得了1株能在玉米秸秆上生长且能力较强,繁殖能力快的菌株,并挑选其作为受体菌株,通过通用引物测序鉴定出该类菌株为欧文氏菌,命名为1-5菌株。其次,以从玉米秸秆筛选到的1-5菌株为转拟南芥活性氧代谢相关酶基因的受体菌株,通过制备1-5感受态细胞和分子生物学技术,构建成功了两种转拟南芥活性氧相关的转基因1-5菌株,即1-5(APX1)和1-5(SOD1)。在此基础上,对1-5(APX1)和1-5(SOD1)进行生长曲线分析,并对两种转基因菌株进行粗蛋白提取和蛋白印迹实验,确定转基因的蛋白表达量。转基因菌株与受体菌株采用控制变量的方法提取蛋白,探索最佳诱导条件,跑蛋白胶后观察目的条带。然后将蛋白纯化,检测目的条带。但是由于未知原因导致菌株蛋白表达量较小。最后利用范氏洗涤法分别测量1-5、1-5(APX1)和1-5(SOD1)菌株和混合1-5(APX1)和1-5(SOD1)菌株对木质素、纤维素、半纤维素的降解效率,结果表明各组降解效率随着降解时间而提高,与原菌株相比,转化后的单一菌株对木质素、纤维素和半纤维素的降解效率高约5%,而1-5(SOD1)又略高于1-5(APX1);复合转化菌株又比单一转化菌株降解效率高约5%,比野生菌株高约10%。这说明转拟南芥APX1和SOD1基因能够提高1-5菌株对玉米秸秆的降解效率,同时也说明玉米秸秆在复合菌株的作用下降解效率相对更高。