研究背景和目的:多囊卵巢综合征（PCOS）是一种复杂和异质的内分泌疾病,通常发生在育龄女性,患病率高达10%,且长期并发症风险增加。PCOS主要表现为高雄激素血症、排卵障碍和卵巢多囊样改变,可导致不孕不育和多种代谢性疾病。PCOS的病因目前仍然在很大程度上是未知的。MicroRNA（miRNA）是在转录后水平上调节基因表达的一种小的非编码RNA（近22个核苷酸长）。异常的miRNA表达水平与疾病的发生有很大关系,包括糖尿病、癌症和动脉粥样硬化,并且miRNA可以作为癌症的预测因子和诊断生物标志物。近年来miRNA在PCOS病理过程中的作用引起了广泛的关注。研究表明,与健康女性相比,PCOS患者miRNA表达的改变可能作为PCOS的无创性的生物标志物和新的治疗靶点。颗粒细胞位于卵泡的表面,该细胞能够通过分泌雌激素来维持卵泡以及卵巢的正常生理功能。卵巢中卵泡的颗粒细胞为卵泡的发育提供营养,在卵泡成熟过程中发挥重要作用。研究发现,和排卵正常女性相比,PCOS患者的颗粒细胞增殖和凋亡出现异常。因此,了解PCOS患者颗粒细胞功能发生紊乱的机制,对于临床预防以及治疗PCOS具有重要的意义。越来越多的研究表明,miRNA在卵泡的发育、成熟以及精子与卵子的结合、胚胎发育过程中扮演重要角色,因此miRNA对于女性正常的生理功能包括生育起着重要的作用。由于PCOS的发病机制与卵泡的发育成熟有关,而miRNA又参与调控卵泡的形成,这暗示miRNA可能与PCOS的发病机制有关。目前相关研究多是围绕PCOS患者血浆及卵泡液中miRNAs的异常表达,而PCOS患者颗粒细胞中的miRNAs异常表达及其在PCOS的发病机制中作用的研究较少。因此,研究PCOS颗粒细胞中异常表达miRNA的生物学功能和调节机制,可以为PCOS的诊断和治疗提供新的策略。在本研究中,我们将重点探讨miRNA在PCOS发病机制中的作用,拟通过对颗粒细胞中表达异常的miRNAs与其靶向蛋白之间的调节关系,进一步加深对PCOS发病机制的认识,并为PCOS的临床诊断以及治疗提供新的思路和理论基础。本研究主要包括以下两个部分:第一部分 PCOS患者颗粒细胞中miRNAs的表达变化及生物学功能研究目的:目前大量研究表明,PCOS患者血清、血浆及卵泡液中miRNAs的异常表达与PCOS的发生发展相关,PCOS患者的卵泡液中有177个miRNA表达增加,86个miRNA表达减少。卵泡内颗粒细胞本身的改变可能是多囊卵巢综合征患者发病的一个内在机制。颗粒细胞中miRNA的表达异常与PCOS的发生密切相关。本研究通过查阅文献,从存在表达差异的多种miRNAs中选择了 6种在PCOS患者血清、血浆和卵泡液中异常表达的miRNAs作为研究对象,然后检测这6种候选miRNAs在入组的PCOS患者及健康对照者卵泡液颗粒细胞中的表达水平,分析确定PCOS患者中异常表达的miRNAs,FSH对E2、miR-186和miR-135a表达水平的影响以及这些异常表达的miRNAs的生物学功能。通过分析miR-1 86和miR-135a对颗粒细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响来探讨miR-186和miR-135a在PCOS患者颗粒细胞中的生物学功能;同时分析PCOS患者血清E2水平和颗粒细胞中miR-186和miR-135a表达水平之间的相关性,明确E2是否对miR-186和miR-135a的表达具有直接调控作用,从而进一步加深对PCOS发病机制的认识,在多囊卵巢综合征的诊断和治疗方面提供新思路。方法:1.本研究选择了 2015年12月至2018年02月在郑州大学第二附属医院生殖中心行辅助生殖助孕的63名PCOS患者和58名月经周期正常的健康女性进行研究,收集PCOS患者及健康对照者取卵后的卵泡液并提取颗粒细胞。应用RT-qPCR检测PCOS患者及健康对照者颗粒细胞中6种候选的miRNAs（miR-154-5p、miR-186、miR-26a、miR-224-3p、miR-135a和miR-103a）的表达差异。2.从PCOS患者和健康对照者的卵泡液中提取颗粒细胞,分别用FSH处理,然后通过ELISA检测细胞上清液中E2水平变化,并利用RT-qPCR检测miR-186和miR-135a表达水平变化。3.为了解E2水平与miR-186和miR-135a的表达之间是否存在关系,我们将PCOS患者分为正常水平E2组（n=24）和高水平E2组（n=39）。为明确E2是否能调节颗粒细胞中的miR-186和miR-135a表达,我们首先用10 nM E2处理KGN颗粒细胞24h,并通过RT-qPCR检测了miR-186和miR-135a的表达水平。然后从健康对照者体内提取了原代颗粒细胞,同样用10 nM E2处理24 h,并通过RT-qPCR检测了miR-186和miR-135a的表达变化。4.用miR-186 mimic或miR-135a mimic处理KGN颗粒细胞 48 h,然后用MTT检测细胞增殖,细胞凋亡用FITC-Annexin V/PI双染法检测,细胞周期通过流式细胞术检测。结果:1.PCOS患者的颗粒细胞中miR-186和miR-135a表达显著上调（p＜0.05）,其余四种miRNAs的表达在两组间没有显著差异。2.FSH处理能提高PCOS患者组和健康对照组颗粒细胞的E2水平以及miR-186和miR-135a的表达水平（p＜0.01）。两组血清E2水平的升高没有显著差异,但是FSH的处理使得PCOS组颗粒细胞中miR-186（p＜0.05）和miR-135a（p＜0.01）的表达水平升高更显著。3.血清E2水平与颗粒细胞中miR-186和miR-135a的水平呈正相关。4.E2处理后,KGN细胞及原代颗粒细胞中miR-186和miR-135a的表达水平均显著升高（p＜0.01）。5.miR-186 mimic或miR-135a mimic处理KGN细胞后,细胞活力均显著高于转染错配对照组的细胞活力（p＜0.01）。6.miR-186 mimic或miR-135a mimic处理KGN细胞后,和转染错配对照组相比,细胞凋亡率显著降低（p＜0.05）。7.miR-186 mimic或miR-135a mimic处理KGN细胞后,和转染错配对照组相比,G2/M期无明显变化,G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著升高（p＜0.05）。第二部分 PCOS患者颗粒细胞中（miR-186和miR-135a）/ESR2信号通路的验证目的:检测PCOS患者颗粒细胞中雌激素受体2（ESR2）和细胞周期素依赖激酶抑制因子1A（CDKN1A）的蛋白质表达变化;然后分析表达异常的miRNAs对ESR2表达水平的影响,在线靶点预测及双荧光素酶分析确定miRNAs的作用靶标,为进一步探讨miRNAs在颗粒细胞生物学功能方面提供理论基础。方法:1.使用免疫印迹检测了来自PCOS患者和健康对照者的颗粒细胞中ESR2和CDKN1A的蛋白质表达水平。2.用miR-186 mimic和miR-135a mimic分别转染KGN颗粒细胞,然后通过RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测差异表达miRNAs对ESR2通路相关mRNA及蛋白（ESR2和CDKN1A）表达的影响。3.应用生物信息学原理,通过三个miRNA靶基因在线预测网站——miRanda、TargetScan和miRDB对miRNAs的靶基因进行预测。4.用miR-186 和miR-135a mimic/inhibitor与ESR2 的报告载体共转染KGN细胞,通过RT-qPCR检测miR-186和miR-135a的表达水平。5.用miR-186 和miR-135a mimic/inhibitor与携带野生型ESR2-3’UTR及其结合位点的突变载体分别共转染至KGN细胞,通过双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性的变化,验证miR-186/ESR2和miR-135a/ESR2之间的靶向关系。结果:1.PCOS患者颗粒细胞中ESR2和CDKN1A的蛋白含量明显降低。2.在用miR-186 mimic或miR-135a mimic转染KGN细胞时,ESR2 和CDKN1A的mRNA和蛋白的表达水平均显著降低（p＜0.05）。3.通过在线预测网站进行靶点预测,发现miR-186和miR-135a的靶点均为ESR2。4.KGN细胞转染miR-186 或miR-135a mimic后,胞内miR-186 和miR-135a的水平显著升高,而转染miR-186 或miR-135a inhibitor后,胞内miR-186 和miR-135a的水平显著降低。5.KGN细胞分别转染miR-186 或miR-135a mimic和inhibitor后,发现miR-186和miR-135a mimic组的荧光素酶活性显著降低。而在miR-186或miR-135a inhibitor转染的细胞中荧光素酶活性增加。且当miR-186和miR-135a的结合位点被突变后,miR-186 和miR-135a mimic和inhibitor都丧失了调控含有ESR2-3’UTR荧光素酶活性的能力。结论:1.PCOS患者颗粒细胞中miR-186和miR-135a表达升高,且E2能直接调节颗粒细胞中miR-186和miR-135a的表达。2.miR-186和miR-135a能够阻断颗粒细胞中ESR2信号通路,通过靶向调节ESR2影响PCOS颗粒细胞的增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能,这进一步揭示了 PCOS的发病机制。