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目的:1.探究建立高粘度骨水泥周围能否形成局部血栓的动物模型,同时验证新型高粘度水泥这一新型材料能够减少局部血栓形成的宏观表象。2.探索新型依诺肝素钠高粘度骨水泥组较普通高粘度骨水泥组中与骨水泥减少血栓形成的作用机制。3.探究不同生物材料形成血栓样本间长链非编码RNA表达的不同,并筛选出新的差异性表达长链非编码RNA。4.初步验证影响血栓形成的长链非编码RNA22719.16/mi R-326-5p/CD40轴的作用关系。方法:1.我们建立新西兰兔颈动静脉体外循环分流器,在分流器内植入不同性质骨水泥线条,观察等时间内不同组间骨水泥条形成血栓的量。2.使用TRIzol Reagent（Invitrogen,USA）按照制造商的说明提取总RNA,用Prime Script RT Reagent Kit（Takara,Japan）对m RNA进行逆转录。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（Servicebio武汉）在Applied Biosystems公司i Q5 Real-Time PCR扩增仪器（Applied Biosystems公司美国）上进行定量实时聚合酶链反应。94℃4min,94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s 40个循环,对每个样品进行3个重复的扩增反应,并进行m RNA分析。3.血管样本用冰冷的PBS洗涤,然后用含有蛋白酶抑制剂的RIPA（Beyotime,中国）裂解。蛋白裂解液在10%SDS-PAGE中分离,然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore,美国）。将膜与含CD31（abcam,UK）、CD40（abcam,UK）、CD62p（abcam,UK）、CD106（abcam,UK）、Endothelin（abcam,UK）、Thrombomodulin（abcam,UK）一抗4℃摇床孵育过夜,将膜置于含对应二抗中孵育1.5小时。将膜置于Western Lightning TM Chemiluminescence Reagent显色剂中30 s,立即将膜置于曝光盒中,并在暗室中对感光胶片进行曝光1 min,而后进行显影、定影处理。4.将冰冻血管组织平衡1小时,4%多聚甲醛固定,常规浸蜡、包埋,切片厚度8μm,石蜡切片常规脱蜡至水,置于Triton X-100（质量分数0.5%）内10分钟,用4%山羊血清白蛋白BAS封闭处理,一抗Anti-CD40-antibody（abcam）1:200,4℃过夜,PBS漂洗3遍,二抗羊抗兔的Ig G抗体（abcam）1:400,室温2h,PBS漂洗,晾干后在荧光显微镜下观察照相。5.留取建模后不同分组4小时新西兰兔血液样本,并用肝素钠作为抗凝剂保存样本,1000*g离心15分钟取上清得到血浆,至于-20°冰箱留存备用。设置标准品孔及样品孔,标准品各加不同浓度50μL,样品孔各加待测样本50μL,空白孔不加。标准品孔及样本孔每孔各加辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL,封膜,37℃恒温箱孵育60min,弃液,吸水纸拍干,每孔加满洗涤液350μL,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸拍干,重复5次。每孔加入底物A、B各50μL,37℃恒温孵育15min,每孔加入终止液50μL,15min内在450nm波长处测定各孔OD值。6.取普通高粘度骨水泥及新型依诺肝素钠高粘度骨水泥血栓样本,采用Tianmo#TR205-200试剂盒进行样本的RNA抽提,抽提的总RNA采用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent technologies,Santa Clara,CA,US）进行检验检测RNA完整性,并使用Qubit?3.0 Fluorometer（Life Technologies,CA,USA）和Nanodrop One spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific Inc,USA）来对总RNA进行浓度及纯度检测。使用的参考基因组版本为Ory Cun2.0.102。7.通过测序公司对新型依诺肝素钠高粘度骨水泥组与普通高粘度组骨水泥中的血栓样本中筛选出的新的差异性表达Lnc RNA与CD40基因进行经典的ce RNA预测,预测出能够对CD40基因具有调控作用的Lnc RNA及mi RNA,并用初步用双荧光素酶报告基因实验对其进行初步验证,并在血管组织中行Lnc RNA探针的FISH实验验证。结果:1.在动物模型中验证高粘度骨水泥能够形成局部血栓,新型依诺肝素钠高粘度骨水泥这一新材料较普通高粘度骨水泥可使得局部形成的血栓量具有明显减少趋势,且具有明显统计学差异。2.新型依诺肝素钠高粘度骨水泥组较普通高粘度骨水泥组血管组织内皮细胞与血栓相关的6个蛋白中CD40表达明显降低,但较假手术组升高,且具有统计学意义。3.新型依诺肝素钠高粘度骨水泥组较普通高粘度骨水泥组血管内皮细胞CD40荧光亮度明显降低,较假手术组升高。三组之间血浆内s CD40L表达无明显统计学差异。4.血栓样本良好,成功筛选出新型依诺肝素钠高粘度骨水泥较普通高粘度骨水泥新的差异性表达长链非编码RNA。5.共转染的ocu-mi R-326-5p模拟物抑制了萤火虫荧光素酶的表达（P＜0.05）,而ocu-mi R-326-5p抑制剂增加了荧光素酶的活性（P＜0.05）。为了确认这种抑制或促进作用取决于预测的mi R-326-5p位点,我们测试了pmir GLO-CD40 m RNA 3?-UTR-MUT及pmir GLO-lnc RNA MSTRG.22719.16-MUT,其识别位点包含突变。此突变体不再响应ocu-mi R-326-5p模拟物（P＜0.05）或抑制剂（P＜0.05）。FISH实验中lnc RNA MSTRG.22719.16探针在新型依诺肝素钠骨水泥组中荧光亮度明显降低。结论:1.通过新西兰兔体外动静脉循环分流器动物模型验证普通高粘度骨水泥均会导致局部附着血栓形成。2.新型依诺肝素钠高粘度骨水泥这一新型材料也会产生局部附着血栓,但较普通高粘度骨水泥所形成的血栓量明显减少。3.新型依诺肝素钠高粘度骨水泥较普通高粘度骨水泥通过减少血管组织内皮细胞中CD40蛋白的表达起到减少局部血栓形成的作用。4.新型依诺肝素钠高粘度骨水泥与普通高粘度骨水泥对于血液循环中的s CD40L影响不大。5.在不同骨水泥形成血栓样本中,长链非编码RNA差异性表达,得到一些新的差异性表达长链非编码RNA,推断这些差异性表达长链非编码RNA在减少血栓形成过程中起到调控作用。6.新的差异性表达的lnc RNA MSTRG.22719.16能够通过ocu-mi R-326-5p调控CD40基因。