拟南芥(Arabidopsis thaliana)是重要模式植物,其基因组研究已经取得了丰硕的成果。大白菜(Brassica rapa)是重要的蔬菜作物,与拟南芥同属十字花科(Cruciferae),拟南芥基因组及其相关技术的研究成果为大白菜基因组研究提供了良好的借鉴。由于大白菜外植体再生(regeneration)困难,表现为较强的基因型依赖性(genotype dependant),制约了遗传转化技术在其功能基因组研究中的应用。近年来,以CRISPR/Cas为代表的第三代基因组编辑技术在农作物基因功能解析和遗传改良上展现出良好的应用前景,然而这一技术在很大程度上依赖于靶标作物的遗传转化技术。公众对转基因生物安全方面的担忧,也在一定程度上制约了遗传转化技术的应用。研究开发不依赖于转基因的DNA-free转染技术,对于促进基因编辑在大白菜功能基因组研究和品种改良上的应用有重要意义。为构建不依赖于转基因的DNA-free转染技术体系,本论文实验以拟南芥和大白菜为试材,系统研究了拟南芥体细胞胚转染受体系统和大白菜单倍体小孢子及小孢子胚转染受体系统的制备方法,探索了DNA-free转染复合体的制备技术,初步建立了细胞穿透肽介导的拟南芥和大白菜DNA-free转染技术体系。1.研究制备了拟南芥体细胞胚转染受体系统,建立了2,4-D诱导的拟南芥幼苗体细胞胚胎发生体系,探明了种子生理年龄、内源ABA含量及贮藏环境对体细胞胚胎发生的影响在1/2 MS液体培养基中,添加1μM 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸),可以有效诱导拟南芥幼苗的体细胞胚胎发生。采种植株生长条件、种子生理年龄和种子贮藏实验,证明了体细胞胚胎发生率随着种子生理年龄的增长而降低,从嫩黄色新鲜角果上采收的野生型拟南芥Col-0种子的体细胞胚胎发生率在49.6%左右,而从棕黄色老角果上采收的种子的体细胞胚胎发生率只有24.7%左右;新鲜种子采收后4℃贮藏60天,体细胞胚胎发生率下降至28.3%左右,极显著低于对照新鲜种子。拟南芥ABA生物合成突变体aba2-1的ABA含量是野生型Col-0的20%,其新鲜种子的体细胞胚胎发生率为3.85%左右。种子的贮藏温度及贮藏时间显著影响体细胞胚胎发生率,-80℃下贮藏5年的拟南芥种子的体细胞胚胎发生率仍为43.6%,极显著高于室温下贮藏5年的种子。在增氧环境下贮藏的种子,2周内就会使新鲜种子的体细胞胚胎发生率的下降至33.9%左右。2.研究制备了大白菜单倍体小孢子和小孢子胚转染受体系统,优化了难出胚大白菜品系游离小孢子培养技术体系证明了基因型对大白菜小孢子胚胎发生有显著的影响,优化了小孢子胚胎发生率较高的大白菜DH系’FT’以及小孢子胚胎发生率较低的DH系‘春大将’和‘多抗新3号’的游离小孢子培养体系。32℃热激处理24h对于‘春大将’和‘多抗新3号’小孢子胚的形成有显著的促进作用。32℃热激处理’FT’24h,可诱导出胚柄状小孢子胚,诱导率为0.01%。‘春大将’和‘多抗新3号’的小孢子胚在含琼脂0.8%的MS培养基中的成苗率分别为38.74%、35.48%,显著高于含琼脂1.2%的MS培养基的成苗率。大白菜’FT’花蕾长度2.4-2.7mm、培养密度为20,000~40,000个/ml条件下,小孢子成胚率最高。3.研究制备了DNA-free转染复合体CPP-mCherry融合蛋白,摸索出CPP-mCherry融合蛋白的纯化方法将9个串联精氨酸(R9)、1个半胱氨酸(cys)、报告蛋白mCherry和组氨酸标签His-tag的DNA序列依次构建在pET 45b+表达载体内,并将此载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,用IPTG诱导原核表达。结果表明,在28℃下,1mM IPTG诱导表达5小时,可获得R9-mCherry融合蛋白。200 W超声波破碎原核细胞60秒后,用Ni柱纯化含有组氨酸标签的目标蛋白,再用MWCO透析膜去除非目的蛋白,可获得高纯度的CPP-mCherry融合蛋白。纯化后的蛋白浓度在1mg/ml以上,可用于下游DNA-free转染试验研究。4.构建了基于CPP-mCherry融合蛋白的拟南芥体细胞DNA-free转染技术体系以拟南芥野生型Col-0根尖及叶肉细胞为R9-mCherry融合蛋白的转染受体,用浓度范围为10μg/ml-100μg/ml的R9-mCherry融合蛋白转染,室温下过夜孵育,经激光共聚焦显微镜镜检观察,可见细胞穿透肽融合蛋白R9-mCherry转入拟南芥叶肉细胞及根尖细胞中。利用R9-mCherry融合蛋白进行转染,全过程无外源DNA的参与,拟南芥根尖的转染效率达到100%。这一结果为建立不依赖于转基因技术的植物体细胞基因编辑系统打下了基础。5.构建了基于CPP-mCherry融合蛋白的大白菜小孢子DNA-free转染技术体系构建了细胞穿透肽介导的大白菜单倍体DNA-free转染技术体系。大白菜DH系’FT’的小孢子和3周龄大小的小孢子胚状体均可作为R9-mCherry融合蛋白的转染受体。R9-mCherry融合蛋白的适宜浓度为50-100μg/ml,室温下过夜孵育。经激光共聚焦显微镜镜检观察,R9-mCherry融合蛋白可转染至’FT’小孢子的细胞核内。大白菜DH系’FT’小孢子的转染效率为8.13%,小孢子胚的转染效率达94.79%,转染后的小孢子胚状体可再生植株。研究结果为建立高效的不依赖于转基因的大白菜单倍体基因编辑系统奠定了基础。