论文部分内容阅读
目的据研究表明，基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP1）对细胞外基质形成具有重要作用；本课题前期研究发现含人组织激肽释放酶1（hTK1）基因过表达具有部分抑制血管平滑肌细胞增殖和改善血管再狭窄的作用，但两者联合应用时对血管平滑肌细胞增殖、迁移及血管重塑是否具有协同效应或叠加效应，目前尚未明了。本课题首先构建含基因hTK1和hTIMP1双基因共表达的重组腺病毒载体，并观察目的基因在大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）中表达情况。方法第一部分1.购买含hTIMP1基因的原始质粒，经鉴定其正确性后，采用酶切、PCR扩增及产物回收、连接酶切产物，经热休克等克隆构建含强绿色荧光蛋白（EGFP）和hTIMP1的重组穿梭质粒，并鉴定其正确性。2.选择相应内切酶位点，对含hTIMP1基因的重组质粒和pDC316-hTK1质粒（本研究室保存）进行酶切并扩增目的基因片段，将两者PCR产物回收、连接、热休克法转染感受态大肠杆菌和挑取克隆，构建含hTK1和hTIMP1双基因的重组质粒，经PCR、酶切分析和测序方法鉴定其正确性。3.将重组质粒线性化，并同骨架病毒质粒pBHGloxE1,3Cre于293A细胞中包装，经包装获得重组腺病毒，用TICD50法测定病毒滴度。第二部分1.采用组织贴块法原代培养来自Sprague-Dawley （SD）大鼠胸主动脉VSMCs，经鉴定后，选取3-5代细胞进行实验。用三种重组腺病毒（Ad5-EGFP、 Ad5-hTIMP1-EGFP与Ad5-hTK1-hTIMP1）感染细胞，分别以不同感染复数（MOI）和不同感染时间，观察目的基因的表达情况。2. Real-Time PCR法测目的基因的转录水平表达。3. Western Blot法检测目的蛋白表达。4.细胞免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果1.经PCR、酶切和测序分析结果，重组质粒pDC316-hTIMP1-EGFP和pDC316-hTK1-hTIMP1构建正确，在293A细胞中成功包装重组腺病毒Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1,其滴度分别为7.0×1011vp/ml和8.5×1011vp/ml。2. Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后，Real-TimePCR法检测目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的mRNA水平呈现高表达，并呈现感染复数（50-150MOI）和时间（1-3d）依赖性增加。3. Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后，Wester-blot法检测目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的蛋白呈现高表达，并呈现感染复数（50-100MOI）依赖性增加。4. Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后，细胞免疫荧光方法检测发现目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的蛋白呈现表达。红色标记为目的基因蛋白在细胞中的表达,蓝色标记为细胞核染色。结论1.采用双启动子CMV策略，首次成功构建并包装了含hTK1和hTIMP1双基因共表达的重组腺病毒载体Ad5-hTK1-hTIMP1，病毒滴度为7.0×1011vp/ml。2.双基因重组腺病毒载体感染大鼠VSMCs后，检测到目的基因转录水平及蛋白水平呈现独立高表达。