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肌内脂肪(Intramuscularfat, IMF)是肉质细嫩多汁和口感好的物质基础,IMF含量的增加可以使肌肉嫩度、多汁性和肉色得到提高。目前在对猪肉质的评定指标中,肌内脂肪的含量已经成为肉质指标中最关键的参数。但自二十世纪七十年代以来,国内外在瘦肉型猪的选育中一直侧重于对瘦肉率的选择提高,高瘦肉率的选择导致瘦肉型猪IMF含量降到了1.5%左右,低于了最适范围,极大地降低了猪肉品质。如何能在保证瘦肉率的前提下提高IMF含量,已成为育种者研究的目标。PPARγ2在脂肪细胞分化,成熟中起着关键作用,研究表明,PPARγ2决定哺乳动物的体脂分布,与肌肉中的脂肪含量有关。因此,本研究以PPARγ2作为候选基因,构建了肌肉特异性真核表达载体,从细胞水平和转基因模型小鼠进行研究细胞或肌肉超表达PPARγ2的影响,期望发现肌肉超表达PPARγ2和IMF以及其他指标的关联,为培育高品质瘦肉猪建立转基因模型。取得的主要研究成果有：1.以真核表达载体pEGFP-N1为框架,从猪MCK基因的BAC中采用基因抓捕技术,钓取了7Kb的MCK启动子序列,构建载体pEGFP-N1L-MCK, SalI和NotI进行双酶切,得到大片段pEGFP-N1L-MCK。以人工合成的PPARy2cDNA全长质粒(pMD-18-PPARy2)为材料,分别用SalⅠ和Not I进行双酶切,得到基因PPARy2片段。将前面两部得到的大片段pEGFP-N1L-MCK和PPARy2cDNA进行连接,得到真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARy2.通过载体部分测序,PCR检测,以及BglⅡ的酶切鉴定无误,说明真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARy2构建成功。2.以猪35日龄胚胎为材料,培养出原代成纤维细胞系,并将构建好的真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARy2瞬时转染成纤维细胞和C2C12细胞,RT-PCR检测表明,PPARy2能够在成纤维细胞和C2C12超表达,并且使脂肪合成相关基因SCD2、LPL、ACC等表达上调。同时,将线性化的载体转染小鼠的成肌细胞C2C12,经G418筛选,获得稳定转染的细胞株,PCR检测阳性,RT-PCR检测表明,阳性细胞PPARy2较阴性细胞表达大幅增加。通过以上两种细胞转染实验可见MCK启动子能够带动PPARy2在成纤维细胞和成肌细胞中超表达。3.通过显微注射法得到阳性Founder小鼠5只,分别将阳性公母小鼠与阴性异性小鼠交配,生下F1代,对2周龄小鼠采用PCR技术检测出阳性小鼠。通过RT-PCR和Western Blot检测发现PPARy2在阳性小鼠骨骼肌和心肌高表达,肝脏,肾脏中等,脂肪,小肠,睾丸等表达量很少,这一结果与MCK在哺乳动物不同组织的表达相符,表明我们构建的真核表达载体能够在转基因小鼠中正常表达,也表明猪MCK启动子和小鼠MCK启动子一样,能够驱动基因在肌肉组织中超表达。4.我们对骨骼肌中脂肪合成,转运等相关基因通过Real Time PCR对mRNA检测发现脂肪相关基因表达得到不同程度的增加,如脂肪酸结合蛋白(FABP4) mRNA增加13倍,脂蛋白酯酶(LPL)增加1倍,DGAT1增加51%,脂肪酸合成酶(FAS)增加1.1倍,而能够降解脂肪的激素敏感脂肪酶(HSL)降低了62%。同时也发现SCD2表达减少。通过连续测定小鼠4-16周体重显示,转基因阳性小鼠体重与阴性小鼠差异不显著。通过对肌肉中甘油三酯的测定,阳性小鼠骨骼肌甘油三酯增加30%(p<0.01),游离脂肪酸增加16%(p<0.01),而血液中甘油三酯和血糖均差异不显著。我们对肌肉组织中脂肪酸组成进行了气相色谱测定,发现多不饱和脂肪酸C18：2、C20：4、C22：6增加,达到差异极显著水平。C16：1增加(P<0.01)而C18：1减少(P<0.01)。实验还对骨骼肌糖代谢相关基因进行检测,发现,葡萄糖转运蛋白1(Glut1),葡萄糖转运蛋白4(Glut4),磷酸葡萄糖异构酶(glucose phosphate isomerase1),果糖二磷酸酶(fructose bisphosphatase2),丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isoenzymel)等表达量增加,磷酸变位酶(phosphoglycerate mutase1)表达减少,糖元合成酶(glycogen synthase2)差异不显著。5.在试验中,对皮下脂肪和肌肉中的棕色脂肪相关基因进行检测,发现皮下脂肪中棕色脂肪特意基因UCP1无论在mRNA水平(157fold, P<0.01),还是蛋白水平,都提高很多倍,另一个棕色脂肪基因PRDM16也增加了79%(P<0.01),另外PGC1α (2.2fold, P<0.01)、Cidea (21fold, P<0.01)、Cox7a (7.4fold, P<0.01)都不同程度的增加,且达到极显著水平。6.实验对肝脏脂肪相关基因进行了检测,发现肝脏中PPARy2增加8倍多,FAS增加210倍,DGAT1增加了93%,而HSL降低到了13%,FABP4增加了1倍多,说明肝脏合成多的脂肪酸和甘油三酯被转运到了其他组织,这与肝脏组织切片的HE染色结果一直,肝脏中脂肪变化差异不显著。