胰腺癌中survivin的表达意义及RNAi对PANC-1细胞凋亡和化疗敏感性影响的研究

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[目的]胰腺癌对绝大部分化疗药物耐药。存活素(survivin)基因是凋亡抑制蛋白家族成员中抑制凋亡作用最强的一种,在大部分恶性肿瘤组织和细胞中高表达,是肿瘤增殖和化疗耐药的重要因子。本研究的主要目的有:(1)探讨survivin在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理的关系。(2)观察胰腺癌细胞株PANC-1中survivin的表达及其在化疗药物吉西他滨作用后的变化。(3)运用RNAi载体抑制survivin的表达对诱导PANC-1细胞凋亡的影响。(4) RNAi抑制survivin的表达对增加化疗药物吉西他滨化疗敏感性的影响。为探索胰腺癌新的治疗方法奠定实验基础。[方法](1)运用免疫组化法检测35例胰腺癌手术切除标本和10例癌旁胰腺组织,分析survivin的表达和临床病理特征的关系。(2)培养胰腺癌细胞PANC-1,加入吉西他滨,运用RT-PCR和Western blot检测survivin的表达。(3)构建以U6为启动子的RNAi载体并转染PANC-1,运用RT-PCR和Western blot检测survivin的表达,FCM检测凋亡指数和Hoechest 33258检测凋亡形态。(4) MTT、FCM和Hoechest 33258检测PANC-1对化疗药物吉西他滨的敏感性。[结果](1)免疫组化显示胰腺癌组织中有survivin的阳性表达,而癌旁组织中无survivin的表达。胰腺癌组织中其表达的阳性率(26/35,74.29%)明显高于癌旁组织(0/10,0%),差异有统计学意义(P<0.05)。survivin在胰腺癌组织中的阳性率与肿瘤的临床分期和病理分级有关;两病理因素分组间差异有统计学意义(P<0.05),而与肿瘤的远处转移无明显关系;远处转移分组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)用1μg/ml及10μg/ml浓度的吉西他滨作用胰腺癌细胞株24h和48h,survivin mRNA水平分别上升了(1.34±0.12)倍、(2.40±0.17)倍和(3.33±0.20)倍、(4.41±0.18)倍,蛋白水平分别上升了(1.20±0.07)倍、(1.48±0.19)倍和(2.90±0.04)倍、(4.50±0.20)倍,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)转染survivin的RNAi载体后24h、48h,survivin mRNA和蛋白的瞬时抑制率分别为52.67%±3.51%、75.33%±3.06%和58.00%±3.61%、76.67%±4.73%;流式细胞仪检测的凋亡指数分别为9.33%±1.53%和14.57%±1.50%;Hoechst33258染色发现,PANC-1细胞出现核皱缩、浓染和碎裂等典型的凋亡形态。(4) Survivin抑制后,PANC-1对吉西他滨的敏感性增加,流式细胞仪检测转染后48h凋亡指数由15.67%±1.16%增加到35.67%±1.53%,差异有统计学意义(p<0.05),吉西他滨的IC50由1.24±0.11μg/ml下降到0.39±0.07μg/ml,差异有统计学意义(p<0.05)。[结论](1)Survivin在胰腺癌组织中的阳性率高于癌旁组织,其与病理分级和临床分期的关系表明survivin可能在胰腺癌的增殖和预后中起重要作用。(2)胰腺癌细胞株的化疗耐药可能通过吉西他滨诱导survivin的表达上调而增强。(3)以U6为启动子的survivin的RNAi载体,能有效地抑制胰腺癌细胞株PANC-1中survivin的表达,并且诱导细胞凋亡。(4)胰腺癌细胞株PANC-1对吉西他滨的化疗敏感性能够通过运用RNAi技术抑制survivin的表达而增强。
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