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本文采用PCR分析方法对7种14株产桔霉素的红曲菌中合成桔霉素基因——pksCT的保守性进行了研究；运用DNA重组技术构建了红曲菌pksCT gene的置换型打靶载体pHD116；通过原生质体PEG介导和电击转化，利用pHD116敲除了橙色红曲菌(M．aurantiacus)AS3．4384中的pksCT gene，并对该基因缺失株的产毒、产色素等功能进行了分析研究。本文还对运用RecET重组系统对快速构建长同源臂置换型打靶载体的方法进行了初步探讨，为红曲菌基因打靶研究提供了一个快速构建长同源臂载体的途径。本文的主要研究结果如下：1、采用PCR分析方法，从14株红曲菌的基因组DNA中均扩增到pksCT基因的翻译起始区部分序列(668bp)和终止密码子区部分序列(591bp)，扩增产物的测序结果通过NCBI进行BLAST同源性分析，结果表明，本文中选用14个扩增产物的序列之间具有高度同源性，且分别与Genbank中紫色红曲菌中的pksCT gene启动子和终止密码子区部分序列一致。结果显示pksCT在14株产桔霉素红曲菌菌株中具有高度地保守性。2、以红曲菌中合成桔霉素基因——pksCT为靶基因，以高产桔霉素的橙色红曲菌(M．aurantiacus)AS3．4384的基因组DNA为模板，扩增靶基因pksCT的翻译起始区部分序列(65-733)A和终止密码子区部分序列(8349-8940)B为靶基因的同源臂序列。通过酶切、连接和转化等DNA重组技术，成功地构建了一个两端含pksCT gene同源臂序列、中间为潮霉素抗性基因的置换型打靶载体——pHD116。该载体中靶基因pksCT gene的同源臂序列，能靶向性精确地界定并敲除基因组上的靶基因，并通过潮霉素B抗性筛选靶基因缺失株。3、优化了红曲菌原生质体PEG介导和电击转化体系中原生质体的浓度以及打靶载体质粒DNA量的条件，并利用原生质体PEG介导转化和电击转化将置换型打靶载体pHD116转入橙色红曲菌(M．aurantiacus)AS3．4384中，敲除了靶基因pksCT gene，采用潮霉素抗性筛选和基因组DNA的PCR扩增法筛选，获得一株pksCT gene缺失株PHDS26，其桔霉素表达量比原始菌株降低了97.2％，同时红色色素和黄色色素的表达量分别提高了49.4％和28.8％。4、合成一对引物，分别在它们的5′端设计与pHD116上潮霉素B抗性基因和上pUC18载体同源的55bp短序列；以橙色红曲菌的基因组DNA为模板，PCR扩增pksCT gene两端外侧同源臂E、F为线性打靶DNA，电击转化到含RecET重组系统的大肠杆菌宿主菌YZ2005中，在RecET重组酶介导下，经过两次同源重组，分别以E和F(长度分别为2437、2694bp)置换pHD116中的同源臂A和B(长度分别为668、591bp)，快速构建了具有长同源臂E、F的打靶载体pHF08。