DNA分子作为一种新型的功能材料,已经被广泛用于生物传感、分子自组装以及DNA计算中。从分子层面上看,DNA能够起到桥梁作用,将分子识别、分子自组装和分子计算这三个前沿研究领域联系起来,例如,DNA适配体能够对目标物进行特异性识别,在生物传感器、核酸纳米机器及分子逻辑器件的设计构建方面具有普遍应用。这些DNA器件在细胞环境识别,体内原位分析与特异检测,生理过程及病理机制研究等方面具有诱人前景。然而,如何确保探针进入细胞并稳定存在而不被细胞内的核酸酶降解;如何确保进入细胞内的探针能够对靶标进行高灵敏、高选择性地分析;如何确保传感器只对指定的细胞内的靶标响应,尤其是靶标也存在于细胞外或其他非指定细胞的时候,是相关研究需要解决的关键问题。针对这些问题,我们研制开发具备环境识别判断能力的智能性传感器,从核酸纳米结构、生物传感和逻辑计算三个层面分别解决探针的细胞摄入、靶标分析和环境识别问题,并将其有效整合。本论文在智能性核酸传感器的设计中,将核酸传感元件有效负载在框架核酸纳米结构中,赋予其优良的细胞内吞能力和生物稳定性,引入细胞环境因素(ATP、H+、K+等)通过合理地设计逻辑电路,并利用DNA逻辑电路调控纳米分析器件,识别模拟细胞内外环境的和细胞内靶标的分析。本论文的研究思路和成果将会对智能化诊断、可控性药物释放等个性化纳米医学具有借鉴意义。本论文的主要内容如下:1.硫磺素作为荧光配体的无标记ATP适配体传感分析。ATP主要存在于细胞内液中,细胞内液中的ATP与细胞外液中的ATP的浓度相差几个数量级并保持一定的平衡,ATP水平的异常波动会引发多种生理疾病。相对平衡的浓度差使得ATP可以作为区分细胞内、外环境的一项重要生理指标。传统的ATP适配体传感器大都需要对ATP适配体进行荧光标记,可能会削弱了 ATP适配体(ABA27)对ATP的亲和力,同时增加实验操作的复杂性和实验成本。我们在研究中发现ATP和荧光配体一硫磺素(ThT)与ABA27的竞争性绑定机制并从机理上进行了深入研究。ThT能够有效绑定ABA27增强荧光发射信号,ATP能够置换与ABA27绑定的ThT使得荧光强度显著降低。基于这一原理,我们ThT作为信号读出,构建了一种无标记ATP适配体传感器,成功地检测到ATP,其对ATP的可视化检测限为5 μM,这个浓度恰好是细胞外ATP的浓度上限。这个传感器对ATP具有很好的选择性,为无标记的ATP高选择性检测提供了一种新型的信号读出模式。2.环境响应的智能DNA逻辑电路设计及其可控分子传感应用。围绕DNA适配体传感器在原位分析应用中面临的环境识别判断问题,我们以细胞内、外浓度差异显著的两种固有的细胞成分(ATP和K+)模拟细胞环境的因子,将ATP适配体和G-四链体引入构建的H型核酸纳米结构中构建能够识别模拟细胞环境的智能DNA电路。将ATP、K+和核酸的分析单元集成到该结构中,基于Toehold介导的链置换(TMSD)作用和目标物诱导的适配体变构的原理,实现了 H型DNA纳米结构对AIP、K+和DNA的可控响应。在不改变任何输入物质的前提下通过微调H型DNA纳米结构,我们成功构建了“AND-AND”、“OR-AND”、“AND-OR”和“OR-OR”四种不同的逻辑电路。此外我们将设计的H型DNA纳米结构有效地应用于模拟细胞环境的识别和MCF-7细胞裂解液中核酸的传感分析中。“H1”结构能够对接收的ATP和K+相关信息进行加工处理,判断细胞内、外环境,并向次级核酸传感器反馈并控制核酸纳米结构与模拟的细胞内核酸之间的作用进行传感分析。这种H型DNA纳米结构和模块化构建各种逻辑电路平台的方法这种细胞环境响应的智能DNA逻辑电路核酸分析器件对新型逻辑器件的设计提供了新的思路,对靶向药物递送和活细胞分子成像等生物医学研究具有重要意义。3.细胞环境识别的DNA逻辑电路用于胞内的分子荷载递送及mRNA成像。蛋白质、抗癌药物、siRNAs、和ASOs等的分子荷载、胞内递送和体内激活可控释放是生物医学的一个巨大的挑战。这里我们设想以TK1 mRNA为靶标,DNA框架核酸(FNA)纳米结构作为运输载体,利用细胞的内源性成分(ATP分子和H+)原位激活内吞的FNA纳米结构卸载受细胞环境控制的分子荷载进而实现对mRNA的胞内成像,为分子荷载的胞内递送和体内激活可控释放提供一种解决方案。为了实现这一方案,我们以四棱台(TSP)作为框架,将ATP适配体(ABA27)和i-motif设计于TSP的对边DNA中,内置包含ASO的双链作为TK1 mRNA的传感元件进而构建了 FNA纳米结构,基于这个FNA脚手架我们构建了两个级联的逻辑门(OR-AND和AND-AND)能够对ATP和H+产生不同响应,FNA内吞进入目标细胞后,细胞内源的ATP分子和H+有效地控制荷载物ASO双链从TSP框架上的释放并和TK1 mRNA作用产生荧光信号,实现对TK1 mRNA的胞内成像。该方法能够进一步用于利用pH值和ATP水平异常调节肿瘤组织中基于mRNA的理疗。