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视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)是位于视网膜最内层的一层神经元，其轴突聚集形成视神经向大脑投射，视网膜和视神经均属中枢神经系统。视网膜感光细胞形成的神经冲动经RGCs和视神经传向大脑产生视觉。外伤和多种眼科疾病可导致视神经损伤，进而引起RGCs凋亡。因中枢神经系统神经元缺乏增殖分裂能力，RGCs一旦死亡将导致视觉永久丧失。因此，阻止RGCs死亡是治疗视神经损伤的前提，目前保护RGCs的方法以药物治疗为主。依托咪酯(etomidate，ET)为非巴比妥类静脉麻醉药，选择性作用于含有β2或β3亚单位的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)A型(GABAA)受体，促使氯离子内流，使细胞膜超极化而发挥麻醉作用。近年来研究发现ET尚具有神经保护作用，ET可减轻前脑缺血大鼠海马神经元的损伤，对海人藻酸引起的海马神经元损伤有保护作用，还可促进脊髓损伤后脊髓功能的恢复。我们课题组通过体内实验发现ET对视神经损伤后RGCs具有保护作用，但ET神经保护作用的机制尚不明确。本研究再次观察了ET在体内对视神经损伤后RGCs的保护作用，并利用原代培养的RGCs划伤模型观察了ET在体外对损伤RGCs的保护作用，进而研究了ET对RGCs损伤后氧化应激反应的影响。具体内容如下：
第一部分依托咪酯对视神经损伤后大鼠视网膜神经节细胞的保护作用
目的研究ET对视神经损伤后RGCs是否具有保护作用。
方法
体内实验：于左眼球后1mm处切断18只雄性SD大鼠视神经，视神经眶侧断端5%荧光金逆行标记RGCs，6只动物留作对照组，术后存活2天，其余12只术后立即每日1次腹腔注射ET(4mg/kg，ET组，n=6)或生理盐水(2ml/kg，视神经损伤组，n=6)直至术后7天处死。取各组动物视网膜计数存活RGCs并计算存活RGCs平均密度。
体外实验：神经元培养基原代培养RGCs，Thy1.1和MAP2免疫荧光双标法对培养细胞进行鉴定。细胞生长至第7天时用虹膜刀划伤RGCs，伤后分别给予1μM、5μM或10μMET进行干预，损伤后第7天CCK-8实验检测细胞存活率，AnnexinV/PI实验检测细胞凋亡率。
结果
体内实验：与对照组相比，视神经横断后7天视神经损伤组和ET组RGCs平均密度均明显下降，但ET组RGCs平均密度明显高于视神经损伤组。
体外实验：Thy1.1和MAP2免疫荧光双标显示培养的细胞为RGCs。划伤后7天与对照组相比，RGCs划伤组RGCs存活率明显降低，RGCs凋亡率明显增高。1μMET未能提高RGCs存活率和降低RGCs凋亡率，而5μM和10μMET可提高RGCs存活率和降低RGCs凋亡率。与5μMET相比，10μMET的作用更为明显。
结论ET对视神经损伤后7天及RGCs划伤后7天的RGCs起到保护作用。
第二部分依托咪酯促进视神经损伤后大鼠视网膜神经节细胞存活的机制研究
目的研究ET对视神经损伤后RGCs的保护作用是否与抗氧化应激有关。
方法
体内实验：216只雄性SD大鼠，随机分为对照组、视神经损伤组和ET组(每组n=72)。于左眼球后1mm处切断视神经损伤组和ET组动物视神经，立即每日1次腹腔注射ET或生理盐水直至处死(给药剂量同第一部分)，对照组动物不进行干预。分别于术后6、12、24小时和7天(每组每一时间点n=18)取视网膜检测一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量(每一检测项目n=6)。
体外实验：原代培养的RGCs生长至第7天时给予1μM、5μM或10μMET预处理4小时后，用1000μM的过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)损伤RGCs，伤后12、24和48小时CCK-8实验检测细胞存活率，AnnexinV/PI实验检测细胞凋亡率，取培养液测定NO、MDA和GSH含量。
结果
体内实验：与对照组相比，视神经损伤组术后12小时视网膜NO和MDA含量明显升高，GSH含量明显降低。ET可降低视神经损伤后视网膜NO和MDA含量并升高GSH含量。视神经损伤后6、24小时和7天时，三组视网膜各氧化应激指标无显著差异。
体外实验：与对照组相比，在损伤后12、24和48小时H2O2损伤组RGCs存活率明显降低，RGCs凋亡率明显上升，细胞培养液NO和MDA含量明显升高，GSH含量明显降低。在H2O2损伤后12、24和48小时，1μMET对RGCs的存活率、凋亡率和培养液各氧化应激指标无明显影响；5μM和10μMET均可提高细胞存活率，并降低细胞凋亡率，减少培养液中NO和MDA含量，升高GSH含量。与5μMET相比，10μMET的作用更为明显。
结论ET对视神经损伤后RGCs的保护作用与抗氧化应激相关。
第三部分依托咪酯抗氧化应激机制的研究
目的研究ET通过何种途径发挥抗氧化应激的作用。
方法
体内实验：54只雄性SD大鼠随机分为对照组、视神经损伤组和ET组(每组n=18)。于左眼球后1mm处切断视神经损伤组和ET组动物视神经，立即腹腔注射ET或生理盐水一次(给药剂量同第一部分)；对照组动物不进行干预。术后12小时取各组视网膜，实时荧光定量PCR和Western-Blot实验观察ET对视神经损伤后视网膜诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases，GPX)1的mRNA及蛋白表达量以及丙烯醛(acrolein)含量的影响。
体外实验：原代培养的RGCs生长至第7天时给予5μM或10μMET预处理4小时后，用1000μM的H2O2损伤RGCs，伤后12、24和48小时收集细胞，实时荧光定量PCR和Western-Blot实验观察ET对H2O2损伤后RGCs的iNOS、Nrf2、HO-1和GPX1的mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量的影响。
结果
体内实验：与对照组相比，视神经损伤组术后12小时视网膜iNOS、Nrf2及HO-1mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量明显升高，而GPX1mRNA表达量无明显变化。ET可降低视神经损伤后视网膜iNOS的mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量，升高Nrf2和HO-1mRNA和蛋白表达量，对GPX1的mRNA表达量无明显影响。
体外实验：与对照组相比，H2O2损伤后12、24和48小时RGCs的iNOS、Nrf2及HO-1的mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量明显升高，而GPX1的mRNA表达量无明显变化。5μM和10μMET均可降低iNOS的mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量，升高Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达量，对GPX1的mRNA表达量无明显影响。与5μMET作用相比，10μMET的作用更为明显。
结论ET通过抑制iNOS和上调Nrf2/HO-1的表达以及减少acrolein的生成和促进acrolein的清除起到抗氧化应激作用。
第一部分依托咪酯对视神经损伤后大鼠视网膜神经节细胞的保护作用
目的研究ET对视神经损伤后RGCs是否具有保护作用。
方法
体内实验：于左眼球后1mm处切断18只雄性SD大鼠视神经，视神经眶侧断端5%荧光金逆行标记RGCs，6只动物留作对照组，术后存活2天，其余12只术后立即每日1次腹腔注射ET(4mg/kg，ET组，n=6)或生理盐水(2ml/kg，视神经损伤组，n=6)直至术后7天处死。取各组动物视网膜计数存活RGCs并计算存活RGCs平均密度。
体外实验：神经元培养基原代培养RGCs，Thy1.1和MAP2免疫荧光双标法对培养细胞进行鉴定。细胞生长至第7天时用虹膜刀划伤RGCs，伤后分别给予1μM、5μM或10μMET进行干预，损伤后第7天CCK-8实验检测细胞存活率，AnnexinV/PI实验检测细胞凋亡率。
结果
体内实验：与对照组相比，视神经横断后7天视神经损伤组和ET组RGCs平均密度均明显下降，但ET组RGCs平均密度明显高于视神经损伤组。
体外实验：Thy1.1和MAP2免疫荧光双标显示培养的细胞为RGCs。划伤后7天与对照组相比，RGCs划伤组RGCs存活率明显降低，RGCs凋亡率明显增高。1μMET未能提高RGCs存活率和降低RGCs凋亡率，而5μM和10μMET可提高RGCs存活率和降低RGCs凋亡率。与5μMET相比，10μMET的作用更为明显。
结论ET对视神经损伤后7天及RGCs划伤后7天的RGCs起到保护作用。
第二部分依托咪酯促进视神经损伤后大鼠视网膜神经节细胞存活的机制研究
目的研究ET对视神经损伤后RGCs的保护作用是否与抗氧化应激有关。
方法
体内实验：216只雄性SD大鼠，随机分为对照组、视神经损伤组和ET组(每组n=72)。于左眼球后1mm处切断视神经损伤组和ET组动物视神经，立即每日1次腹腔注射ET或生理盐水直至处死(给药剂量同第一部分)，对照组动物不进行干预。分别于术后6、12、24小时和7天(每组每一时间点n=18)取视网膜检测一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量(每一检测项目n=6)。
体外实验：原代培养的RGCs生长至第7天时给予1μM、5μM或10μMET预处理4小时后，用1000μM的过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)损伤RGCs，伤后12、24和48小时CCK-8实验检测细胞存活率，AnnexinV/PI实验检测细胞凋亡率，取培养液测定NO、MDA和GSH含量。
结果
体内实验：与对照组相比，视神经损伤组术后12小时视网膜NO和MDA含量明显升高，GSH含量明显降低。ET可降低视神经损伤后视网膜NO和MDA含量并升高GSH含量。视神经损伤后6、24小时和7天时，三组视网膜各氧化应激指标无显著差异。
体外实验：与对照组相比，在损伤后12、24和48小时H2O2损伤组RGCs存活率明显降低，RGCs凋亡率明显上升，细胞培养液NO和MDA含量明显升高，GSH含量明显降低。在H2O2损伤后12、24和48小时，1μMET对RGCs的存活率、凋亡率和培养液各氧化应激指标无明显影响；5μM和10μMET均可提高细胞存活率，并降低细胞凋亡率，减少培养液中NO和MDA含量，升高GSH含量。与5μMET相比，10μMET的作用更为明显。
结论ET对视神经损伤后RGCs的保护作用与抗氧化应激相关。
第三部分依托咪酯抗氧化应激机制的研究
目的研究ET通过何种途径发挥抗氧化应激的作用。
方法
体内实验：54只雄性SD大鼠随机分为对照组、视神经损伤组和ET组(每组n=18)。于左眼球后1mm处切断视神经损伤组和ET组动物视神经，立即腹腔注射ET或生理盐水一次(给药剂量同第一部分)；对照组动物不进行干预。术后12小时取各组视网膜，实时荧光定量PCR和Western-Blot实验观察ET对视神经损伤后视网膜诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases，GPX)1的mRNA及蛋白表达量以及丙烯醛(acrolein)含量的影响。
体外实验：原代培养的RGCs生长至第7天时给予5μM或10μMET预处理4小时后，用1000μM的H2O2损伤RGCs，伤后12、24和48小时收集细胞，实时荧光定量PCR和Western-Blot实验观察ET对H2O2损伤后RGCs的iNOS、Nrf2、HO-1和GPX1的mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量的影响。
结果
体内实验：与对照组相比，视神经损伤组术后12小时视网膜iNOS、Nrf2及HO-1mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量明显升高，而GPX1mRNA表达量无明显变化。ET可降低视神经损伤后视网膜iNOS的mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量，升高Nrf2和HO-1mRNA和蛋白表达量，对GPX1的mRNA表达量无明显影响。
体外实验：与对照组相比，H2O2损伤后12、24和48小时RGCs的iNOS、Nrf2及HO-1的mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量明显升高，而GPX1的mRNA表达量无明显变化。5μM和10μMET均可降低iNOS的mRNA和蛋白表达量以及acrolein含量，升高Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达量，对GPX1的mRNA表达量无明显影响。与5μMET作用相比，10μMET的作用更为明显。
结论ET通过抑制iNOS和上调Nrf2/HO-1的表达以及减少acrolein的生成和促进acrolein的清除起到抗氧化应激作用。