背景在全球范围内,结肠癌每年导致约69万人死亡。尽管近年来手术和放化疗等治疗方法的进展大大提升了患者的生存几率,但现行治疗方法的有效率仅为50%左右,进展期患者的预后更加堪忧,最终结肠癌的总死亡率仍高达40%。肿瘤的发生和发展是多因素导致的,近年来越来越多的证据支持肿瘤干细胞理论,认为肿瘤干细胞是导致肿瘤发生进展的重要原因之一。肿瘤干细胞是指肿瘤内极小部分的细胞亚群,具有自我更新、形成异质性亚群,并形成肿瘤的能力,它已经在肠癌、胃癌、乳腺癌等多种实体肿瘤中被发现。肿瘤干细胞具有自我更新、无限增殖、高致瘤性、强耐药性等多种生物学特性,它可能是肿瘤发生、发展、复发、转移等各种恶性行为的源头。因此,研究者提出——应将抗肿瘤干细胞作为新的抗肿瘤策略。Wnt/β-catenin是参与结肠癌发生发展的重要通路,它的激活也是维持肿瘤干细胞“干性”并促成肿瘤发生、增殖所必需的。其具体机制可能涉及其下游相关靶基因的上调,如调控细胞周期、增殖的cycling D1、c-myc,凋亡抑制基因survivin等等;另外,通路的关键蛋白β-catenin在结肠癌干细胞中高表达,β-catenin入核后形成的β-catenin/TCF复合物可以直接调控多能干细胞转录因子Oct4、Nanog的表达,这可能是Wnt/β-catenin通路维持干性的重要机制之一。Wnt/β-catenin信号激活后,结肠癌干细胞的克隆能力和致瘤能力也明显增强;抑制Wnt/β-catenin通路信号则明显影响结肠癌干细胞的克隆能力和致瘤能力。因此调控Wnt/β-catenin信号通路活性可能是抗肿瘤干细胞过程中非常重要的一环。目前尚缺乏对肿瘤干细胞有特异性作用的药物,肿瘤干细胞对放化疗等不敏感,常规的治疗方法能够消灭大多数肿瘤细胞,但幸存的耐药肿瘤干细胞会导致肿瘤的复发,表现为肿瘤的体积虽然缩小了,但肿瘤发展的进程并未被阻止。因此许多研究者将目光投向天然药物。中药在我国临床实践中被广泛应用于抗肿瘤治疗,近期一些中药提取物如姜黄素、白藜芦醇、桑辛素等陆续被报道具有抗肿瘤干细胞的功效。我科经验方“消痰散结方”在临床实践中获得较好疗效,能够提高中晚期消化道肿瘤患者的生存质量并延长其生存期。课题组前期工作基础表明,消痰散结方能够在体内外抑制结肠癌细胞的增殖、转移,并对CD44阳性为表型的胃癌干细胞的生长有抑制作用。因此,我们推测,靶向抑制结肠癌干细胞可能是消痰散结方抗结肠癌的机制之一。基于此,本课题立足于结肠癌干细胞的增殖和致瘤能力,力求探索中药抗肿瘤干细胞的可能机制。目的验证无血清悬浮培养成球系统能否富集结肠癌干细胞,鉴定球体细胞的体外增殖和体内致瘤能力,观察球体细胞中肿瘤干细胞标志物和Wnt/β-catenin信号通路相关因子的表达;体内外观察消痰散结方对结肠癌干细胞增殖的抑制作用,及其对结肠癌干细胞标志物表达的影响,基于Wnt/β-catenin信号通路的调控作用探讨消痰散结方可能的作用机制。方法第一部分:结肠癌干细胞的富集与鉴定人结肠癌HCT116细胞株稳定传代后,在无血清悬浮培养系统中培养成球以富集结肠癌干细胞;通过CCK-8细胞增殖实验和裸鼠皮下成瘤实验,对亲代和球体细胞的体外增殖能力和体内致瘤能力进行比较;通过免疫荧光和PCR实验比较球体细胞和亲代细胞中多能干细胞转录因子Oct4、Sox2、Nanog及其他肿瘤干细胞标志物表达水平的的差异。第二部分:结肠癌干细胞Wnt/β-catenin通路相关因子的表达通过WB和PCR实验,比较球体细胞和亲代细胞中,Wnt/β-catenin通路关键蛋白及通路相关配体、受体的m RNA表达差异。第三部分:消痰散结方对结肠癌干细胞的体外作用及相关机制消痰散结方水提物制备冻干粉末,溶解在细胞培养基中,以备体外干预细胞使用。体外通过CCK-8实验检测消痰散结方对亲代细胞和球体细胞增殖的抑制作用;5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(Edu)渗入实验进一步检验消痰散结方作用后细胞的增殖能力;消痰散结方预处理亲代HCT116细胞24h后,观察其在无血清悬浮培养系统中的成球情况;流式检测细胞周期;Annexin V-PI双染色法检测细胞凋亡;WB和PCR实验检测消痰散结方对结肠癌干细胞标志物和Wnt/β-catenin通路相关因子表达的影响。第四部分:消痰散结方对结肠癌干细胞的体内作用及相关机制球体细胞接种于裸鼠肩背部皮下,造模成功后随机分入各组,各组裸鼠给予不同浓度的消痰散结方灌胃,每周测量裸鼠体表移植瘤大小和裸鼠体重,连续饲养4周后,处死裸鼠并剥离肿瘤称重;通过WB和PCR实验检测相关肿瘤干细胞标志物和Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达。球体细胞接种于裸鼠肩背部皮下后,予高剂量消痰散结方灌胃,观察荷瘤鼠生存期。结果第一部分:结肠癌干细胞的富集与鉴定亲代HCT116细胞在无血清悬浮培养系统中稳定形成细胞球体;球体细胞的体外增殖能力强于亲代细胞,差异有统计学意义(p<0.01)。体内皮下移植瘤实验中,致瘤所需的最少细胞数,球体细胞(5万)明显少于亲代细胞(50万);达到100%成瘤率所需的最少细胞数,球体细胞(50万)也明显少于亲代细胞(100万);动物连续饲养4周后,球体细胞所致瘤体的重量和体积也明显大于亲代细胞,差异有统计学意义(p<0.01)。亲代细胞中多能干细胞转录因子Nanog有表达,Oct4和Sox2低表达或不表达;球体细胞中,Nanog、Oct4和Sox2的表达均明显上调,相比亲代细胞差异有统计学意义(p<0.01)。q RT-PCR法检测其他结肠癌干细胞标志物的m RNA表达水平,球体细胞中,Lgr5、CD44和CD133 m RNA表达水平明显强于亲代细胞,差异有统计学意义(p<0.01)。第二部分:结肠癌干细胞干性标志物和Wnt/β-catenin通路相关因子的表达球体细胞中Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin、TCF4、c-Myc、Survivin表达均上调,通路配体Wnt1、Wnt3a、Wnt10b,通路受体Frizzled1、Frizzled2、Frizzled3、Frizzled7,及通路辅助受体Lrp5、Lrp6的表达均高于亲代细胞(p<0.05)。第三部分:消痰散结方对结肠癌干细胞的体外作用及相关机制体外实验中,消痰散结方抑制亲代HCT116细胞增殖,作用72h的IC50值为0.9mg/ml;消痰散结方抑制结肠癌干细胞增殖,抑制作用呈浓度-时间依赖性,作用72h的IC50值为0.25mg/ml;经消痰散结方预处理72h的亲代HCT116细胞,在无血清悬浮培养系统中几乎无法增殖成球,存活细胞数明显减少(p<0.01);Edu渗入法进一步证实消痰散结方各浓度组均能抑制细胞增殖能力,处于分裂增殖期的细胞比例降低(p<0.01)。干性标志物Nanog、Oct4的表达在消痰散结方中、高浓度组下调,Sox2的表达在高浓度组下调;其他结肠癌干细胞标志物CD133、Lgr5 m RNA的表达水平也下调(p<0.01)。消痰散结方明显抑制球体细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性,通路关键蛋白β-catenin、TCF4及下游靶基因蛋白c-Myc、Survivin表达明显下调,上游机制涉及两方面:磷酸化Akt表达下调,GSK-3β表达上调;另外通路配体和受体m RNA的表达水平不同程度下降。消痰散结方阻滞球体细胞周期于S期和G2/M期,相关细胞周期调控蛋白Cyclin A2、Cyclin B1、CDK、CDK2表达下调;消痰散结方同时激活Caspase3、Caspase7,上调Bax表达、下调Bcl-2表达,诱导球体细胞凋亡。第四部分:消痰散结方对结肠癌干细胞的体内作用及相关机制体内实验中,低剂量组未显示抑制移植瘤生长作用,中、高剂量消痰散结方能够抑制结肠癌干细胞移植瘤的生长,瘤重较对照组明显减少,差异有统计学意义(p<0.05);高剂量组消痰散结方可延长荷瘤鼠生存期,提高生存率。消痰散结方中、高剂量组中,Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin、TCF4和c-Myc表达下调;干性标志物Oct4和Nanog表达也不同程度下调,其他结肠癌干细胞标志物CD44和CD133 m RNA表达水平也下调(p<0.01)。结论1、无血清悬浮培养系统培养的球体细胞富集了结肠癌干细胞。其体外增殖能力和体内致瘤能力均强于亲代细胞,球体细胞中部分结肠癌干细胞标志物和Wnt/β-catenin通路相关因子的表达均显著上调。2、消痰散结方能够在体外抑制结肠癌干细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡,在体内抑制结肠癌干细胞移植瘤的生长,高剂量组消痰散结方可延长荷瘤鼠生存期,提高生存率;并能在体内外下调部分结肠癌干细胞标志物的表达。3、消痰散结方能显著抑制Wnt/β-catenin通路活性及下游靶基因转录表达。其上游调控机制可能涉及以下两方面:一是抑制Akt活性、激活GSK-3β功能,降解β-catenin,抑制通路活性;二是广泛下调Wnt/β-catenin通路中发挥正性调节作用的受体、配体表达,减少通路受体配体反应,抑制通路活性。