【摘 要】
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目的:糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease,DKD）是糖尿病最严重的微血管并发症,后期易发展为终末期肾脏病,其具有发展速度快、难控性、高发病率、高死亡率和低知晓率等特点,为社会公共卫生事业带来了沉重负担。目前针对该疾病,尚未有效方法可以治疗。因此,针对DKD发病机制,寻找一种新型、切实有效的预防、延缓甚至逆转DKD的方法显得尤为迫切。脂肪干细胞（Adiposederived
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目的:糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease,DKD）是糖尿病最严重的微血管并发症,后期易发展为终末期肾脏病,其具有发展速度快、难控性、高发病率、高死亡率和低知晓率等特点,为社会公共卫生事业带来了沉重负担。目前针对该疾病,尚未有效方法可以治疗。因此,针对DKD发病机制,寻找一种新型、切实有效的预防、延缓甚至逆转DKD的方法显得尤为迫切。脂肪干细胞（Adiposederived Stem Cells）来源外泌体（Exosome,Exo）可减轻足细胞损伤,但其在DKD中的确切功能和机制尚未完全阐明。因此,本研究主要通过构建负载miRNA-145a-5p的脂肪干细胞来源外泌体（ADSCs-Exo-miRNA145a-5p）研究其对DKD的治疗作用。方法:1.体外实验验证miRNA-145a-5p通过调节BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）诱导自噬抑制高糖诱导的足细胞损伤:模拟高糖环境,首先通过WB检测各组细胞BNIP3表达量,qRT-PCR检测miRNA-145a-5p表达量,再对各组足细胞分别通过干扰BNIP3、转染miRNA145a-5p mimics处理,通过WB,CCK8法,流式等方法检测各组细胞BNIP3,p62和LC3 II/I等凋亡蛋白表达情况,细胞活力和凋亡情况。同时使用双荧光素酶报告基因检测miR-145a-5p和BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）的结合调控。2.构建并鉴定ADSCs-Exo、ADSCs-Exo-miRNA145a-5p:构建转染miRNA145a-5p的ADSCs,分别提取获得ADSCs-Exo,ADSCsExo-miRNA145a-5p;分别使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）和电子显微镜对两类Exo进行计数,形态和数量评估,通过WB验证Exo标志蛋白。3.体内实验验证ADSCs-Exo-miRNA145a-5p对DKD小鼠的改善作用:（1）模型构建:本实验采用db/db,db/m小鼠,对照组为db/m小鼠,随机将15只db/db小鼠分组,分别为DKD模型组,DKD+ADSCs-Exo-NC,DKD+ADSCs-Exo-miR 145a-5p,每组5只。待饲养至12周db/db小鼠出现肾损时,对4组小鼠分别尾静脉注射:PBS200μL,PBS200μL,含ADSCs-Exo的PBS溶液（蛋白量100μg）,含ADSCs-Exo-miR 145a-5p的PBS溶液（蛋白量100μg）,每周1次,持续8周。（2）作用观察:ELISA检测各组小鼠尿微量白蛋白、血尿素氮、血清肌酐含量,WB检测各组小鼠BNIP3、p62及LC3II/I等凋亡蛋白表达量,qRT-PCR检测各组小鼠miR 145a-5p表达量。采用免疫荧光、苏木精和伊红染色等方法对各组小鼠肾、肝、心、肺组织进行评估。结果:体外实验发现,高糖处理的足细胞中,BNIP3表达量较对照组明显增加,miRNA145a-5p含量显著减少。分别对足细胞进行BNIP3干扰表达,转染miRNA145a-5p处理,发现高糖诱导的处理组足细胞p62蛋白表达下降,LC3II/I升高,自噬显著增加,细胞活力增加,凋亡减少;成功构建并通过鉴定确认获得了ADSC-Exo,ADSC-Exo-miRNA 145a-5p。在体内实验时发现,ADSC-ExomiRNA 145a-5p注射可降低DKD小鼠尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐,显著抑制BNIP3表达,促进自噬,减少了DKD小鼠足细胞凋亡和肾脏病理损害,同时对DKD小鼠体重无明显影响,心脏、肺、肝脏组织具有一定改善作用。结论:1.MiRNA-145a-5p可通过调节BNIP3诱导自噬抑制高糖诱导的足细胞损伤;2.ADSCs-Exo-miR-145a-5p可通过抑制BNIP3的表达起改善小鼠DKD的作用;3.ADSCs-Exo注射对小鼠无明显毒副作用,安全有效。
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