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第一部分小鼠免疫性肝炎模型的建立及NK-1受体拮抗剂L-703,606对小鼠免疫性肝损伤的影响目的采用经小鼠的尾静脉注射刀豆蛋白A (Concanavalin A, Con A),制造小鼠免疫性肝损伤模型,通过检测肝组织中P物质(substance P, SP)的含量变化,证实SP介导的神经源性炎症在肝炎的发生和发展中的作用；同时从生化、病理学、细胞因子等方面分析比较,SP受体即神经激肽-1受体(Neurokinin-1receptor, NK-1R)的阻滞剂L-703,606对小鼠免疫性肝炎肝损伤的干预作用,进一步证实神经内分泌系统对肝炎的调控机制,为各种肝炎的发病机制提供实验依据。方法将60只雌性小鼠随机平分为生理盐水对照组、刀豆球蛋白A (Con A)免疫性肝炎模型组和NK-1R阻滞剂L-703,606干预组,每组20只。生理盐水对照组给予尾静脉注射生理盐水0.2ml；刀豆球蛋白A免疫性肝炎模型组给予尾静脉注射20mg/kg Con A; NK-1R阻滞剂L-703,606干预组在尾静脉注射10mg/kgL-703,606的同时给与等量Con A注射。造模后6小时,用水合氯醛麻醉小鼠,处死所有小鼠并收集血液和肝脏标本,应用酶联免疫吸附(ELISA)法测定对照组和模型组肝脏组织中P物质的含量；应用酶联免疫吸附(ELISA)法分别测定各组小鼠肝组织中的肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白介素-6(IL-6)的蛋白含量及各组小鼠血清中转氨酶ALT、AST水平,HE染色观察肝脏病理变化。结果模型组小鼠肝组织中SP含量显著高于对照组(387.23±29.36pg/mL VS138.52±13.23pg/mL),差异具有统计学意义(P<0.05)；模型组和干预组血清AST、ALT水平均明显升高(P<0.01),但与模型组相比,干预组ALT和AST明显下降(402.22±16.42U/L VS782.37±21.51U/L；581.45±17.51U/L VS1004.25±18.24U/L),差异具有统计学意义(P<0.05);ConA模型组TNF-α和IL-6蛋白含量水平均明显高于生理盐水对照组(49.15±9.33pg/ml VS12.21±7.15pg/ml；281.17±13.12pg/ml VS131.25±10.34pg/ml),差异有统计学意义(P<0.05)。同ConA模型组小鼠比较,L-703,606干预组小鼠TNF-α和IL-6蛋白含量水平下降明显(P<0.05)(20.34±10.14pg/ml VS49.15±9.33pg/ml；152.53±11.16pg/ml VS281.17±13.12pg/ml)。模型组小鼠肝组织病理可见肝细胞索破坏,肝窦稍增宽,内有大量瘀血,肝细胞弥漫性肿胀,核固缩、溶解甚至消失,点、灶状及片状坏死多见,汇管区及中央静脉肝窦内可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润；而干预组的肝组织病理改变明显减轻,肝细胞肿胀坏死及淋巴细胞浸润也较模型组明显改善。结论本实验制造的模型,组织病理显示模型组肝脏点、灶状及片状坏死多见,汇管区及中央静脉肝窦内可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润,与急性肝损害较为符合。模型组小鼠肝组织SP含量、TNF-α和IL-6蛋白含量水平显著高于对照组,说明SP介导的神经源性炎症在肝炎的发生中起到重要的作用。应用NK-1受体阻滞剂L-703,606进行干预,可使干预组小鼠血清AST、ALT水平下降,TNF-α和IL-6蛋白含量水平下降,并伴有肝脏组织病理的减轻,证明阻断SP与其受体的结合对肝脏炎症具有一定的抑制和治疗作用。第二部分P物质和NK-1受体拮抗剂L-703,606对Kupffer细胞产生细胞因子的影响目的探讨P物质对小鼠枯否细胞(Kupffer Cell,KC)分泌功能的影响。观察小鼠枯否细胞在P物质作用下炎症细胞因子水平的变化,进一步探讨SP受体(NK-1R)阻滞剂L-703,606的作用及其作用机制,为临床应用提供新的启示。方法采用Percoll密度梯度离心法分离得到高纯度的小鼠枯否细胞,在过夜培养后冲洗两遍,以5×105/ml的细胞浓度,接种于24孔培养板。采用免疫荧光技术检测NK-1R在枯否细胞中的定位。分离并培养枯否细胞48小时后,分别设立不同浓度SP组,确立其对细胞无毒性的剂量范围。将枯否细胞分为三组,为正常培养液+内毒素100ng/ml组(B组),正常培养液+内毒素100ng/ml+SPluM组(C组),正常培养液+内毒100ng/ml+SPluM+L-703,60610uM组(D组),刺激原代培养的枯否细胞3小时。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠枯否细胞上清液中TNF-α和IL-6水平。应用实时逆转录多聚酶链式反应((reverse transcriptase—polymeras chain reaction,RT-PCR)检测小鼠枯否细胞中NK-lRmRNA的表达。结果离体正常小鼠的枯否细胞NK-1R免疫荧光主要集中在细胞质中。与对照组比较,P物质能增加枯否细胞中NK-lRmRNA的表达增加2.5倍；与对照培养基比较应用NK-1R拮抗剂能使NK-1R mRNA表达的显著减少。经过P物质刺激后,枯否细胞上清液中TNF-α及IL-6分泌水平均明显高于对照组(P<0.01)(92.15±8.56pg/ml VS31.02±7.26pg/ml;194.12±11.09pg/ml VS71.13±9.36pg/ml)而NK-1R阻滞剂即L-703,606能减弱P物质对枯否细胞分泌功能的刺激作用,即应用NK-1R阻滞剂即L-703,606后,枯否细胞上清液中TNF-α及IL-6分泌水平均明显下降(P<0.01)(28.38±5.04pg/ml VS92.15±8.56pg/ml;68.16±9.51pg/ml VS194.12±11.09pg/ml)。结论小鼠枯否细胞中表达NK-1R,体外实验证实P物质能增加枯否细胞中NK-lRmRNA的表达,应用NK-1R拮抗剂能减少NK-lRmRNA的表达。P物质对枯否细胞的分泌功能有激活作用,能使TNF-α及IL-6分泌量增加,而应用NK-1R阻滞剂L-703,606能减弱P物质对枯否细胞分泌功能的刺激。