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卵巢衰老伴随着卵泡池和卵母细胞储备数的减少,以及卵母细胞质量的降低。氧化应激和线粒体功能紊乱是卵巢衰老过程中面临的两个最主要问题。褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）是一种内源性分泌的吲哚胺,可调节机体中多种重要的生理功能。松果体分泌的褪黑素会随着年龄增长逐渐减少,褪黑素处理可有效预防衰老引起的多种组织和细胞的氧化损伤以及线粒体功能紊乱。研究表明褪黑素易被卵巢吸收和利用,通过口服摄入可直接对卵巢功能产生影响,因此使用褪黑素来改善卵巢衰老显得尤为可行。1.在饮水中添加褪黑素喂养年轻雌性昆明小鼠（2–3月龄）12个月,观察其对卵巢衰老的保护作用。褪黑素处理组小鼠血浆中褪黑素的浓度要高于溶剂对照组。当小鼠到达14-16个月龄时,褪黑素喂药组小鼠平均产仔数明显高于同年龄段未处理组。然而需要注意的是无论褪黑素处理与否,年老雌鼠妊娠失败的概率都有所升高。卵泡的数量随着衰老持续降低,但褪黑素处理组卵巢卵泡的数量要明显高于溶剂对照组。与此同时,褪黑素喂药后小鼠闭锁卵泡的数量明显降低。对卵母细胞数进行统计后我们发现,褪黑素处理后小鼠卵巢GV期和排卵后的MII期卵母细胞平均数要高于同年龄段未处理组。对卵母细胞质量进行观察后我们发现,褪黑素处理组卵母细胞的体外成熟率高于溶剂对照组;褪黑素处理后收集到的具有正常纺锤体形态的卵母细胞比例更高;褪黑素的使用减弱了衰老对于卵母细胞原核形成的延迟作用。此外,褪黑素增加了囊胚中Oct4阳性细胞数并减少了囊胚细胞的凋亡率,从而改善衰老卵母细胞的早期胚胎发育。以上这些结果表明褪黑素能延缓昆明小鼠卵巢的衰老。2.卵巢衰老过程中的氧化应激不仅影响到卵泡的发育,同时也损害卵母细胞质量,导致成熟率、受精率、胚胎质量和妊娠率等的降低。收集卵巢观察褪黑素对组织超微结构、氧化损伤、抗氧化酶活性以及抗氧化基因表达的影响。透射电镜观察结果表明褪黑素减轻了衰老引起的卵巢线粒体损伤。褪黑素通过调控抗氧化酶活性和抗氧化基因的表达来降低衰老卵巢中活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）和蛋白质羰基含量以及延缓端粒的侵蚀速度。此外,与溶剂对照组相比,褪黑素处理显著抑制了衰老卵巢中Bax和Cleaved caspase-3的表达,同时增加了Bcl-2的表达。这些结果表明,褪黑素能减弱衰老卵巢的氧化损伤。3.线粒体是机体能量的主要来源,同时也是自由基主要来源和作用靶点。尤其是线粒体功能紊乱是导致衰老的主要因素。长期的褪黑素处理能够降低线粒体ROS的生成,恢复谷胱甘肽（GSH）的水平并且减少了8-羟脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量,从而减弱衰老引起的卵巢线粒体损伤。褪黑素处理雌性小鼠卵巢线粒体中三磷酸腺苷（ATP）的含量要明显高于同龄未处理组。此外,我们检测了线粒体电子传递链复合物I-IV的活性。衰老会降低复合物I、II和III的活性,但不影响复合物IV的活性;然而与同年龄段未处理组相比,褪黑素可显著增强卵巢线粒体中电子传递链的活性。mtDNA水平和ATP含量的不足与衰老引起的卵母细胞发育能力的降低有关。褪黑素处理组小鼠MII期卵母细胞中的mtDNA拷贝数以及GV期和MII期卵母细胞中的ATP水平要显著高于同年龄段未处理组。与此同时,褪黑素处理降低了卵巢衰老导致的线粒体异常分布的卵母细胞比例的升高。mtDNA的异质性与年龄呈正相关,通过变性高效液相色谱法检测我们发现衰老小鼠体内卵母细胞mtDNA在D-loop区域的异质性明显增加,然而褪黑素处理则降低了mtDNA在D-loop区域异质性的发生频率。这些结果表明,褪黑素能改善衰老卵巢的线粒体功能。4.通过H2O2处理小鼠颗粒细胞（原代培养）来模拟机体衰老所引起的氧化应激和线粒体功能紊乱,探讨褪黑素的保护作用机制。体外研究结果证实褪黑素处理后减弱了H2O2诱导的颗粒细胞氧化应激以及线粒体功能紊乱。染色质免疫共沉淀（ChIP）试验表明褪黑素促进了FOXO3A的核转录,从而增强了抗氧化基因SOD2和CAT的表达。特异性的siRNA来干扰AMPK的表达在阻断FOXO3A核转录的同时也减弱了褪黑素的保护作用。重要的是,与同年龄段未处理组相比,褪黑素增加了老龄小鼠卵巢中p-AMPK的水平。5.卵母细胞的体外老化会引起ROS水平的增加、GSH/GSSG比例的降低、透明带的异常硬化以及与线粒体功能有关的线粒体膜电位、mtDNA拷贝数和ATP水平的降低,损害卵母细胞质量和发育潜能。然而10-33 M的褪黑素处理能有效消除卵母细胞体外老化过程中的不良影响。此外,我们同样发现在排卵后MII卵母细胞的老化会引起Sirt3的表达水平的降低和SOD2（K68）乙酰化水平的升高。而Sirt3抑制剂3-TYP阻断了褪黑素在延缓卵母细胞老化中发挥的保护作用。总之,褪黑素长期处理能够减轻氧化应激和维持线粒体功能,从而延缓卵巢衰老。褪黑素的这些保护作用可能与激活AMPK信号通路有关;此外,褪黑素通过调控Sirt3-SOD2途径来延缓MII卵母细胞体外老化。