纤维素是植物细胞壁的主要成分,是自然界中最丰富的聚合物,也是取之不尽用之不竭的生物能源,是目前最为热门的研究材料之一。利用纤维素酶将纤维素转化成单糖,通过微生物发酵过程将单糖转化成乙醇等生物燃料,其具有重要的应用前景。纤维素水解为单糖,需要一系列纤维素酶的作用,而β-葡萄糖苷酶作为这一过程中的限速酶,起着至关重要的作用,是利用天然纤维素材料的瓶颈。近年来,大量文献表明占据白蚁总数75%的高等白蚁具有较强的降解纤维素的能力。本文以高等培菌白蚁黄翅大白蚁Macrotermes barneyi为研究对象,前期在中肠克隆得到的β-葡萄糖苷酶基因(MbmgBG1),其属于GHF1家族,与其他来源的β-葡萄糖苷酶相比,具有较高的葡萄糖耐受性,但酶活力低、热稳定性差,限制了 β-葡萄糖苷酶在食品领域以及工业领域的应用。为了得到酶学性质较好的β-葡萄糖苷酶,我们进行了以下研究:1.黄翅大白蚁由来β-葡萄糖苷酶的分子改造。先前研究了高等培菌白蚁黄翅大白蚁自身来源的β-葡萄糖苷酶,对其转录组进行分析,只有一个GHF1家族的β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)有活性,其葡萄糖耐受性高(1.5 mol/L的葡萄糖,保持60%以上的酶活力),但酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)在食品以及工业领域中的应用。我们对其高度保守区域附近的非保守氨基酸进行定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G 和 V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比野生型分别高出约2倍和4倍。突变体的Kcat/Km值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比野生型强。当酶活力保留60%以上时,野生型所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L,而 F167L 为 2.0 mol/L,R354K 为 3.0 mol/L。2.大白蚁营发酵单胞菌Dysgonomonas macrotermitis由来β-葡萄糖苷酶的研究。高等白蚁是天然降解纤维素模式生物中降解能力最高的,几乎能完全降解自身食用的天然纤维素材料。白蚁自身的β-葡萄糖苷酶远远不能完全降解白蚁食用的纤维素材料,但白蚁肠道内的共生微生物具有较强的纤维素降解能力。其中黄翅大白蚁后肠内分离得到的D.macrotermits菌株(后肠内的第二优势菌群)具有较高的纤维素酶活力。我们对在D.macrotermitis的β-葡萄糖苷酶基因进行分析研究,共发现了 15个的β-葡萄糖苷酶基因,进行异源表达后,其中6个具有活性。3.大白蚁营发酵单胞菌Dysgonomonas macrotermitis由来β-葡萄糖苷酶(DysbglE)的表达与分析。对D.macrotermitis由来β-葡萄糖苷酶活性最高的DysbglE进行核苷酸序列分析。DysbglE的基因含有一个开放阅读框架(ORF),2 286个碱基对编码一个多肽,其中66个碱基对编码的为信号肽,属于GHF3家族。去除信号肽,在大肠杆菌JM109中异源表达,分子量为80.15 kDa,通过分子筛分析推测其可能为同源二聚体,在DysbglE的催化反应中Arg612和Phe623起到至关重要的作用。对DysbglE酶学性质分析,其最适反应温度和pH分别为45℃和5.5;以pNPG为底物时,Km值和Vmax分别为1.4 mM和666.67 U/mg;葡萄糖耐受性较差,IC50 为 0.1mol/L。4.β-葡萄糖苷酶基因(DysbglE)在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及产酶条件优化。在食品领域中,β-葡萄糖苷酶可作为食品添加剂和水果风味增香剂,这要求我们使用易于纯化、安全性高的表达系统。枯草芽孢杆菌具有长期制备发酵食品的历史,属于一般公认安全(GRAS)微生物范畴,具有蛋白质分泌能力。所以我们选择枯草芽孢杆菌WB800N异源分泌表达β-葡萄糖苷酶,更有利于促进β-葡萄糖苷酶在食品领域的应用。本实验在枯草芽孢杆菌WB800N中成功分泌表达了β-葡萄糖苷酶DysbglE,并利用响应面分析优化其发酵条件,比最初表达量提高了 4-5倍。总之,本文首先改造了黄翅大白蚁自身的β-葡萄糖苷酶基因MbmgBG1,其次分析了 D.macrotermitis由来的全部β-葡萄糖苷酶基因(15个),它们都属于GH3家族,其中6个在大肠杆菌中表达,对其中酶活性最高的β-葡萄糖苷酶(DysbglE)进行了详细的酶学性质研究。同时利用枯草芽孢杆菌表达系统成功分泌表达了 β-葡萄糖苷酶DysbglE。本研究使我们更加深入的理解了白蚁对纤维素材料的降解能力,同时也为研究白蚁及其共生微生物的共生机制奠定了基础。