一、研究背景周围神经缺损的修复与重建是目前世界性的难题,临床治疗的金标准是白体神经移植,但存在供体来源有限、供区感觉及运动功能受损等弊端,因此探索周围神经损伤修复的新方法具有重要意义。组织工程学研究为解决这一问题提供了新思路。种子细胞和导管支架制成的复合体是构建组织工程的核心。目前,组织工程中应用较多的种子细胞有：雪旺细胞、骨髓间充质干细胞、骨骼肌干细胞、神经干细胞以及胚胎干细胞等。骨髓间充质干细胞(]nesenchymal stem cells,MSCs)是细胞治疗中常用的一种,具有自我更新和多向分化的潜能,在适宜的培养条件下,能够在体外稳定的生存和繁殖,并能保持多向分化能力,是体外操作的理想细胞。骨髓间充质干细胞诱导分化为雪旺细胞和神经元样细胞能分泌神经生长因子,对神经修复有促进作用。另外,骨髓间充质干细胞取材容易,且能在体外迅速增殖和诱导分化,移植后可以在免疫豁免区存活,避免了免疫排斥反应,因而用于周围神经损伤的修复治疗研究,具有广阔的应用前景。目前导管材料主要包括：生物型神经导管、人工合成导管、复合组织导管。导管材料作为人工细胞外基质为细胞提供赖以粘附、生长、分化、和增殖的场所,有利进行正常新陈代谢。许多研究表明,神经再生过程中,断端的神经再生和神经营养因子、神经生长因子等的作用关系密切,当神经缺损超过一定距离后,营养物质供应缺乏,导致远端和近端不能重新连接。前期课题组自行设计并合成了精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子缓释导管,并用于修复大鼠l0mm坐骨神经缺损,结果表明该导管对大鼠坐骨神经缺损具有良好的桥梁作用和促进神经生长的作用,而且动物实验证明该新型神经导管复合材料没有细胞毒性。本实验通过定向诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,鉴定其特异性标志物的表达,并将其作为种子细胞加入神经导管中,制成新型导管复合材料。二、研究目的1、前期课题组从仿生设计的角度出发,以神经基底膜结构与组成的分析研究为基础,将生物可吸收PDLLA作为基本骨架材料,添加能够促进神经生长的PRGD成分及能诱导神经生长的NGF,添加能调整置入区PH值的β-TCP成分,成功构建出PRGD/PDLLA/NGF/β-TCP新型神经导管复合材料,目的旨在通过体外细胞实验评价其细胞亲和性和缓释性能。2、在体外条件下分离、提纯鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并传代培养,加入碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对第三代BMSCs进行诱导,观察细胞形态变化,并用免疫组织化学方法检测诱导分化后的神经样细胞标志物；分化为神经样细胞,目的旨在通过细胞试验评价骨髓间充质干那细胞诱导分化为神经样细胞的可行性。作为周围神经损伤修复的基础研究；3、在验证新型神经导管具有良好的细胞亲和性和缓释性能以及碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)能诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的基础上,将新型神经导管复合材料和骨髓间充质干细胞制成复合体,通过体外细胞生物学评价二者的生物相容性和评估其用于修复大动物长段周围神经缺损的可能性,为下一阶段动物实验研究和临床应用奠定理论基础。三、实验方法1、新型神经导管复合材料的设计与制备从仿生设计的角度考虑,首先以神经基底膜结构与组成的分析研究为基础,自行设计并合成了RGD多肽接枝的高分子聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)(PRGD),以乙酸乙酯为溶剂,分别加入浓度为85%、相对分子质量为10×104～25×104的聚乳酸(PDLLA),浓度为10%的PRGD,浓度为5%、平均粒径小于500nm的β-磷酸三钙(β-TCP)以及微量神经生长因子(NGF),经超声波分散,磁力搅拌,采用溶剂挥发法制备PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合成膜。2、鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化及传代SD大鼠10%水合氯醛腹腔注射,麻醉后体积分数75%7,醇浸泡30min,置于超净工作台上,严格无菌操作下取大鼠双侧股骨和胫骨,将骨骺端剪去,暴露两端骨髓腔,用5ml注射器抽取DMEM液反复冲洗骨髓腔,至骨皮质发白,收集冲洗液于无菌离心管中,1000r/min离心10min,弃去上清液,重悬,计数,调整细胞密度107L-1接种于培养瓶中,加入培养液(含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100g/L),置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育。24h后换液并去除未贴壁的细胞,后每3天换液一次,至细胞基本铺满瓶底用0.25%胰酶消化,按1：2比例传代,进行扩增、纯化培养。每日用倒置相差显微镜观察细胞形态及生长情况。3、BMSCs诱导分化及鉴定3.1BMSCs的增殖和诱导分化；将生长状态良好的第3代细胞用0.25%胰酶消化,收集细胞并调整密度1×105L-1接种于24孔培养板内,分为诱导组和对照组,各设6个复孔,置于37℃,5%CO2饱和湿度下孵育。24h后弃培养基,诱导组加入诱导剂(含20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF的DMEM培养液)培养,对照则继续用含10%胎牛血清DMEM培养,每3天换液1次,连续培养7天,每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长情况。3.2细胞免疫组织化学鉴定诱导7天后,取出培养板做免疫组织化学鉴定,一抗分别为兔抗鼠NSE和β-Tubulin和兔抗鼠GFAP；二抗为异硫氰酸荧光素(fluorescein5(6)-isothiocyanate,FITC)。步骤为：吸弃培养液,4%多聚甲醛固定10min;0.3%Triton-X100透膜10min,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)冲洗3次,山羊血清封闭20min,滴加一抗(1：200)4℃孵育过夜,PBS冲洗3次,滴加二抗(1：100)37℃孵育30min,随机选择10个视野,观察诱导细胞染色阳性的细胞数。主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态特性；②骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的形态变化；③NSE、β-Tubulin、 GFAP的表达情况。4、新型神经导管复合材料浸提液的制备称取灭菌过的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料100mg装入15mL离心管,然后加入3mL细胞培养液。将离心管置于37℃恒温振荡培养箱(100r/min),24h后取出浸提液,按1：9稀释比例加入α-MEM培养液内混匀,浸提液制备过程确保无菌。5、新型神经导管复合材料与BMSCs相容性研究5.1MTT法检测骨髓间充质干细胞活性将生长良好的第3代骨髓间充质干细胞以5×104ml-1密度接种于96孔培养板,分实验组、对照组和空白组(只加培养液,不含细胞,用于调零),实验组加精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合膜浸提液0.2mL,对照组加含体积分数10%胎牛血清的培养液0.2mL,置于37℃,体积分数5%CO2饱和湿度下孵育。隔天半量换液,连续培养7d。分别取培养1,3,5,7d细胞进行MTT法检测(详细步骤参考),在酶联免疫检测仪上选择570nm波长测定吸光度值,记录实验数据。5.2流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率将生长良好的第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板,分为实验组和对照组,实验组加精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料浸提液2mL,对照组加含体积分数10%胎牛血清的培养液2mL,37℃,体积分数5%C02饱和湿度下孵育。每2d换液1次,连续培养7d,分别取培养1,3,5,7d细胞进行Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,记录实验数据和流式散点图,左上象限(FITC-/PI+)为机械损伤细胞,左下象限(FITC-/PI-)为正常活细胞,右上象限(FITC+/PI+)为晚期凋亡或死亡细胞,右下象限(FITC+/PI-)为早期凋亡细胞。(细胞凋亡率由仪器自动计算)。5.3扫面电镜观察BMSCs将无菌的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合膜剪成12孔培养板孔洞大小,与细胞浓度为1×109L-1骨髓间充质干细胞共同置于12孔培养板中,37℃、体积分数5%CO2及饱和湿度条件下孵育。将培养7d后的材料取出,PBS冲洗3次,体积分数2.5%戊二醛4℃固定1h。体积分数30%,50%,75%,80%,90%,100%叔丁醇脱水,前4级脱水各1次,每次10min,后2级脱水各2次,每次10min。保留样本内叔丁醇-20℃冰冻冷藏4h,干燥12h；喷金,在扫描电镜下观察材料表面细胞生长状况。6、主要观察指标6.1NSE、β-Tubulin.GFAP的表达情况。6.2BMSCs在浸提液中生长情况、细胞活力及细胞凋亡率；7、统计学方法结果用x±s表示,应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,组间比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有显著性意义。四、结果1、成功制备出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神经导管,外观呈乳白色,无嗅,无味。材料表面光滑、无裂纹、无毛刺,质地柔软,可折弯,易于缝合。体外培养与RSC96细胞具有较好的细胞亲和性,并可持续释放NGF30天以上。2、骨髓间充质干细胞的培养及诱导：原代BMSCs接种24h内开始出现贴壁现象,此时细胞大多数为圆形。72h后贴壁细胞有伪足伸出,大多数细胞呈梭形并伴有2～3个突起,细胞核较大,圆扁形,可见1～2个核仁。经过三代纯化培养后得到的BMSCs形态为长梭形,形成多个突起并彼此发生联系,完全融合后排列成漩涡状、网状、辐射状结构。BMSCs经bFGF和EGF诱导24h后,部分细胞增殖呈团簇状。继续培养72h后可见部分细胞发出两个或多个突起,胞质回缩,胞体呈多角形或不规则形,折光性明显增强。培养7天后可见星状细胞数目逐渐增多,细胞突起之间相互连接成网状,可见细胞核及核仁。3、细胞免疫组织化学鉴定NSE、β-Tubulin、GFAP表达：BMSCs经诱导分化7天后,部分有核细胞呈现典型的神经元样改变并表达NSE和β-Tubulin阳性,表明其具有神经干细胞特性,GFAP染色结果阴性。4、精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞活力的影响：实验采用MTT法检测实验组和对照组细胞吸光度值,结果发现,在共培养后5,7d,实验组的吸光度值明显高于对照组(P<0.05)。根据吸光度值描绘的生长曲线发现,随着培养时间的延长,实验组和对照组吸光度值逐渐增大,表明细胞活性逐渐增加,实验组吸光度值明显大于对照组,即实验组细胞活性高于对照组。表明精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞不但无毒性作用,还能增加细胞活性。5、精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞凋亡的影响：流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示,实验组(四组都取上午9点时间段测试)细胞凋亡率为(6.43±3.02)%：对照组细胞凋亡率为(16.36±6.88)%,两组比较差异有显著性意义(P<0.05)；共培养7d,流式细胞仪检测结果显示实验组右上象限晚期凋亡细胞数明显较对照组少,而细胞活性明显大于对照组。同样证明精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞无毒性作用,能延长细胞存活时间,具有良好的细胞相容性。6、精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料对骨髓间充质干细胞生长的影响：扫描电镜观察见共培养7d,精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料部分降解,其表面细胞数较多,细胞生长状态良好,体积较大,胞体发出多个突起,并且细胞之间相互连接交织成网状,其轴突较长和较粗,呈典型的神经元样细胞表现,见图6,说明其降解产物无细胞毒性,释放的神经生长因子具有促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用,细胞相容性良好。五、结论1、通过对天然神经基底膜成分的仿生,成功制备出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神经导管,体外实验表明该材料具有良好的生物相容性和细胞亲和性,并能持续释放NGF达30天。2、骨髓间充质干细胞具有较强的自我增殖和分化潜能,在适宜的体外条件可诱导分化为神经样细胞,为周围神经损伤修复的研究提供了新思路。3、试验充分证明精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料与骨髓间充质干细胞具有良好的细胞相容性,可作为优良的载体用于构建人工仿生神经。为下一阶段动物实验奠定了理论基础。