诺如病毒(Norovirus,NoV)是引起世界范围内急性胃肠炎的主要病原体之一,造成严重的公共卫生问题和经济负担。流行病学研究表明GⅡ.4是全球优势流行株,每隔1-3年便出现新的变异株,占到全部NoV感染的85%,而其他基因型NoV则以局部暴发和散发为主。由于NoV基因型别众多,对于NoV疫苗的研制是一个巨大的挑战。迄今为止,尚无针对NoV的特效药物和疫苗。为了研制广谱NoV疫苗,Parra等人根据NoV衣壳蛋白氨基酸的差异性,对GI和GⅡ型NoV进行免疫型(immunotypes)分类,为广谱NoV疫苗的研发提供了理论支持,但尚需要进一步的实验验证。中医药抗病毒性腹泻历史悠久,目前主要集中于轮状病毒胃肠炎的研究,由于NoV未曾纳入常规检测和报告项目,对于诺如病毒性胃肠炎的中医辨治规律尚未见报道,有待于临床研究。本研究成功开展了一起GI.3型NoV暴发性胃肠炎的流行病学调查,基于暴发人群进行了NoV性胃肠炎的中医辨证分析,并对GI型NoV的交叉抗原性进行了研究。(一)一起GI.3 NoV暴发性胃肠炎的流行病学调查2018年7月广西贵港市某仓库暴发了一起胃肠炎感染疫情。课题组参与开展流行病学现场调查,收集暴发人群临床症状、肛拭子和配对血清样本,通过实验室NoV核酸检测和流行病学危险因素分析,证实该起暴发性胃肠炎疫情是GI.3型NoV感染。深入调查发现这是一起水源性暴发疫情:疫区自来水厂的产氯装置已经失修2个月,水中有效氯含量较低,仅0.06mg/mL(国家水质卫生标准为0.3-0.5mg/mL),不能达到良好的消毒效果。结果表明:GI型NoV的局部暴发仍不可忽视,加强水源相关健康管理尤为重要。(二)对NoV暴发性胃肠炎的中医辨证初探基于暴发现场10名急性胃肠炎患者的临床症状进行中医辨证分型,以寒湿困脾证为主,部分患者则表现为湿热蕴脾证,根据NoV胃肠炎的传染和临床特点,属于中医“泄泻”和“疫病”范畴。据此,我们提出:外感疫毒,脾虚湿盛是NoV胃肠炎的主要病因病机,病位主要在脾胃和大小肠,运脾化湿是主要治疗大法。探索NoV胃肠炎的发病特点并提出了初步的临床用药方案。我们的探索结果为中医防治NoV胃肠炎提供了初步的辨证资料,但尚有待于进一步扩大临床观察和疗效评价。(三)GI型NoV交叉抗原性研究利用分子生物学方法,构建代表性GI.2(KF306212)、GI.3(本次暴发标本)和GI.9 NoV(广东省CDC提供)重组质粒,通过原核表达系统表达3种NoV P颗粒蛋白,将得到的3种NoV P颗粒免疫小鼠和豚鼠制备免疫血清。基于P区域序列利用MEGA7.0等软件构建遗传进化树,结果表明:GI.3与GI.2的核苷酸相似度58.7%,而GI.3和GI.9的核苷酸相似度64.5%,GI.3和GI.9型NoV在分支上的分化更近,说明GI.3和GI.9有更近的亲缘关系。基于NoVP颗粒-HBGA受体结合实验,结果表明:GI.2和GI.3 P颗粒与A型唾液结合能力最强,GI.9 P颗粒与分泌型A、B、O和非分泌型N均能结合,结合能力O(0.86)>A(0.76)>N(0.56)>B(0.47),其中与O型结合能力最强。利用制备的小鼠和豚鼠免疫血清开展GI.2、GI.3和GI.9的交叉抗原性研究,结果表明:GI.2、GI.3和GI.9P颗粒所诱导的小鼠血清针对同一基因型P颗粒都有很高的抗体滴度(≥204800),与两种其他基因型的交叉反应也有较高的抗体滴度(≥51200);3种免疫小鼠血清对同源性P颗粒均具有很强的阻断作用(BT50≥800),GI.3和GI.9的NoV免疫小鼠血清对相互间P颗粒均有较高阻断(BT50≥100),对GI.2 P颗粒阻断作用较弱(BT50=25);GI.2型NoV免疫小鼠血清对GI.3和GI.9 P颗粒均无阻断作用(BT50≤12.5)。初步证明GI.3和GI.9的交叉抗原性和交叉保护作用均明显高于GI.2。基于NoV-HBGA实验,运用本次GI.3型NoV暴发疫情收集的急性期和恢复期血清开展GI.3抗体对GI.2和GI.9的交叉抗原性及交叉保护作用研究,结果表明:分别有16和15对GI.3恢复期血清针对GI.3型及GI.9型NoV抗体水平呈现血清转阳(4-64倍);其中13对GI.3恢复期血清针对GI.2型NoV抗体水平呈现血清转阳(4-32倍)。GI.3恢复期血清针对不同基因型的抗体滴度比较采用Kruskal-Wallis检验(x2=6.7,df=2,P=0.036),差异有统计学意义(P<0.05)。与急性期血清比较,15对GI.3恢复期血清对自身具有HBGA受体阻断能力,抗体呈4-64倍升高(血清转阳,BT50≤3200);11对血清对GI.9型有HBGA受体阻断能力,抗体呈4-32倍升高(BT50≤800);然而,仅有5对血清对GI.2有HBGA受体阻断能力,抗体呈4-8倍升高(BT50≤400)。GI.3恢复期血清针对不同基因型的阻断滴度采用Kruskal-Wallis检验(X2=20.3,df=2,P<0.05),差异有统计学意义,表明GI.3和GI.9之间的交叉抗原性和抗体交叉保护能力显著性高于GI.2。主要结论:1.通过实验室检测和现场流行病学调查发现一起GI.3 NoV暴发性胃肠炎疫情。深入调查发现疫区自来水中有效氯含量较低,仅为0.06mg/mL(国家水质卫生标准为0.3-0.5mg/mL),不能达到良好的消毒效果。初步判断水源性污染是该疫情的主要原因,加强水源相关健康管理尤为重要。2.NoV暴发性胃肠炎属于中医“泄泻”和“疫病”范畴,外感疫毒,脾虚湿盛是NoV暴发性胃肠炎的主要病因病机,其病位在脾胃和大小肠,运脾化湿是治疗大法。3.成功表达了GI.2、GI.3和GI.9型NoV P颗粒,P区域序列进化树表明GI.3和GI.9有更近的亲缘关系。基于NoVP颗粒-HBGA受体结合实验,结果表明GI.2和GI.3与A型唾液结合效果最好,GI.9与分泌型A、B、O和非分泌型N均能结合,其中与O型结合效果最好。GI.3和GI.9之间的交叉抗原性及交叉保护作用高于GI.2,实验结果初步证实GI.3和GI.9属于同一免疫型(C型),GI.2属于不同的另一免疫型(B型)。我们的研究结果为基于免疫型理论的广谱疫苗研制策略提供了初步的实验依据。