论文部分内容阅读
背景和目的:宫颈癌发病率在全球女性恶性肿瘤中排名第四,严重威胁女性健康。在临床上,放疗（radiotherapy,RT）是宫颈癌最常用的治疗方法之一,是局部晚期宫颈癌的首选治疗方法（NCCN指南I类证据推荐）,也是早期宫颈癌术后辅助治疗的主要手段,超过60%的宫颈癌患者需要接受放疗[1]。由于肿瘤异质性,部分肿瘤细胞具有先天性放疗抗性,或者多次分割照射诱导部分细胞获得性放疗抵抗,导致部分宫颈癌患者放疗失败。放疗抵抗所引起的局部未控及远处转移是导致宫颈癌预后不良的重要原因,因此探究宫颈癌放疗抵抗的原因及分子机制,寻找有效的放疗增敏剂,提高宫颈癌患者放疗敏感性具有重要意义。PRDX2是过氧化物还原酶家族成员之一,是体内消耗H2O2的主要蛋白酶之一,在人类多种癌细胞和组织中表达升高,并影响生存、增殖和凋亡在内的多种细胞过程。在癌症信号通路中,越来越多的研究表明PRDX2通过与其他信号蛋白相互作用来促进或抑制肿瘤的发生[2]。课题通过构建宫颈癌辐射抵抗株细胞模型及根据临床放疗肿瘤消退情况收集宫颈癌患者组织,进行蛋白组学测序,发现PRDX2是重要的宫颈癌放疗抵抗调控因子。然而,关于PRDX2表达对宫颈癌细胞放射敏感性作用的相关报道较少,因此,本研究主要探索了PRDX2的表达对宫颈癌细胞放射敏感性的影响及作用机制,以期为接受根治性放疗而出现放疗效果不佳的宫颈癌患者提供治疗新思路。研究方法:1.构建辐射抵抗株:以Siha细胞为亲本细胞,给予多次分段照射,累计剂量达80Gy,筛选存活细胞进行培养,构建获得性宫颈癌放射抵抗株R-Siha并进行验证。验证R-Siha细胞构建是否成功主要通过不同剂量下克隆形成能力,照射后DNA双链断裂标记物γ-H2AX的表达,凋亡相关指示蛋白的表达,流式细胞术检测照射后细胞凋亡发生率及周期分布等方法验证。同时利用划痕实验及侵袭实验、Western Blot,检测R-Siha细胞的EMT表型及相关蛋白表达情况。2.R-Siha细胞与亲本细胞Siha遗传背景相似,二者分子水平差异即为导致放射敏感性差异的主要原因。因此将Siha细胞与R-Siha细胞进行蛋白质组学测序,寻找差异基因的表达,并进行m RNA水平及蛋白水平的验证。3.回顾性分析确诊宫颈癌且病理类型为鳞癌的患者,患者均接受完整全疗程根治性放疗（±化疗）,治疗后根据RECIST标准判断治疗疗效,将疗效达CR与NCR的患者放疗前组织进行蛋白组学测序,验证差异基因。利用GEO数据库,接受根治性放疗（±化疗）后治疗疗效达CR与NCR基因组学测序结果,再次进行差异基因的表达验证。4.选取6株宫颈癌鳞癌细胞株ME180,MS751,HT-3,C33a,Siha,Caski及构建的辐射抵抗株R-Siha细胞。确定不同细胞株中PRDX2基础表达量,PRDX2表达相对较高者为:C33a、Siha、ME180;表达量较低者为:Caski、HT-3及R-Siha。通过si RNA技术干扰C33a及Siha中PRDX2的表达,并检测敲减PRDX2后不同剂量下C33a及Siha克隆形成能力。后利用慢病毒构建PRDX2稳定敲减的细胞株Siha-sh PRDX2,并检测照射后0h、4h、8h、12h时γ-H2AX的表达量,与凋亡密切相关的蛋白Cleaved-Caspase3的表达情况,及流式细胞检测凋亡的发生率,进而确定敲减PRDX2后对宫颈癌细胞放射敏感性的影响。通过慢病毒感染技术在R-Siha细胞中过表达PRDX2,通过上述几种方法检测过表达PRDX2后对R-Siha细胞放射敏感性的影响。引入PRDX2的活性类似物胶霉毒素（gliotoxin,GT）,确定胶霉毒素的IC50进而确定胶霉毒素的作用浓度,通过上述方法检测引入胶霉毒素后对R-Siha细胞放射敏感性的影响。5.确定敲减PRDX2后引起宫颈癌Siha细胞放疗抵抗的下游关键蛋白,并进行验证。检测敲减PRDX2后,宫颈癌Siha细胞的EMT表型变化及Western Blot检测EMT标志性蛋白的改变。然后将关键蛋白进行敲减,检测是否可以逆转辐射敏感性及EMT表型。过表达PRDX2及加入胶霉毒素后,再次验证对信号通路的影响。6.体内实验。利用雌性裸鼠建立皮下移植瘤模型,验证加入PRDX2的活性类似物胶霉毒素是否可以逆转敲减PRDX2对宫颈癌辐射敏感性的影响。结果:1.宫颈癌获得性辐射抵抗株R-Siha构建成功。平板克隆实验证实,不同剂量下R-Siha细胞的克隆形成能力高于Siha细胞,照射后R-Siha细胞在不同时间点γ-H2AX的表达低于Siha细胞。流式细胞术验证R-Siha细胞经辐射后早期凋亡+晚期凋亡比例显著低于Siha细胞。同时,Western Blot证实R-siha细胞在照射后抗凋亡蛋白Bcl2显著高于Siha细胞。R-siha细胞周期分布于G2/M期比例显著高于Siha细胞。R-siha细胞相较于Siha细胞的迁移、侵袭能力更强,更具EMT表型。2.细胞测序及组织测序证实PRDX2在辐射抵抗株及NCR组中表现为下调。通过q PCR技术及Western Blot技术,证实PRDX2在m RNA水平及蛋白水平在R-Siha细胞中均表现为下调。在高表达PRDX2的细胞株中（C33a及Siha细胞）敲减PRDX2后,平板克隆形成实验证实在不同剂量下,Siha-sh PRDX2克隆形成能力更强;辐射后,Siha-sh PRDX2表达γ-H2AX上升时间更慢,表达窗口期更短,短时内下降。同时,流式细胞术及Western Blot结果证实,Siha-sh PRDX2凋亡发生率更低。即,敲减PRDX2可宫颈癌细胞辐射敏感性降低。在R-Siha细胞成功过表达PRDX2,平板克隆形成实验证实在不同剂量下,过表达组克隆形成能力下降;辐射后过表达组表达γ-H2AX上升迅速,持续高水平表达,并显著高于对照组。同时,流式细胞术及Western Blot结果证实,过表达PRDX2凋亡发生率更高,证实过表达PRDX2可促进宫颈癌辐射敏感性。引入PRDX2的活性类似物胶霉毒素,与过表达PRDX2得到一致结论,促进宫颈癌辐射敏感性。3.蛋白互相结果提示STAT3与PRDX2具有强相关性。经验证,敲减PRDX2后,经辐射P-STAT3表达水平增加。为验证P-STAT3是PRDX2调控宫颈癌辐射敏感性的关键蛋白,在药物水平及基因水平分别于Siha-sh PRDX2细胞中抑制STAT3及P-STAT3的表达,克隆形成实验证实宫颈癌Siha-sh PRDX2细胞抑制STAT3的表达后,辐射敏感性增加,STAT3的下游基因抗凋亡基因Bcl2表达水平发生下调。同时宫颈癌Siha-sh PRDX2细胞发生EMT表型逆转,Western Blot也证实EMT关键标志性蛋白发生相应改变。在过表达PRDX2及加入胶霉毒素后,验证对STAT3/Bcl2信号通路的影响,实验结果证实过表达PRDX2及加入胶霉毒素可抑制STAT3/Bcl2信号通路的激活,同时EMT表型逆转。4.PRDX2表达与P-STAT3水平呈现竞争性抑制的关系,提示PRDX2与P-STAT3存在蛋白互作关系。敲减STAT3后,PRDX2表达增加。4.体内实验证实PRDX2的活性类似物胶霉毒素可以逆转敲减PRDX2引起的辐射抵抗,并未产生明显的毒副反应。结论:1.PRDX2在宫颈癌鳞癌放疗敏感株中高表达,放疗抵抗株中低表达。2.PRDX2下调引起照射后STAT3/Bcl2信号通路激活,是其调控宫颈癌放疗抵抗的分子机制。3.胶霉毒素可阻断照射后STAT3/Bcl2信号通路激活,可逆转PRDX2异常下调引起宫颈癌的辐射抵抗。4.辐射诱导PRDX2与P-STAT3之间的蛋白间相互作用,是PRDX2影响P-STAT3转录活性的可能机制。