创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder,PTSD)是一种严重的灾难性事件或威胁,如战争及自然灾害等所引发的巨大痛苦或惊吓、或遭遇悲剧等,导致的精神、身心症状的持续异常状态或焦虑综合征。近年来,随着战争、社会暴力的频发、自然灾害等意外的增多使得PTSD的发生率也逐渐增高,然而因为对于其发病机制尚不明确,目前尚缺少有效的治疗和预防手段。PTSD患者主要症状特点是看到或听到与原来的创伤经历相似的线索,可能会联想到原先经历过的创伤恐惧情景,从而表现出创伤性情景的再体验、回避与创伤经历相关的事物、高度警觉、受惊、做噩梦、失眠、情感麻木及性格大变等等,使他们无法准确地分辨现处的安全环境与原来的创伤环境之间的区别,这种症状表现与恐惧记忆的过度泛化密切相关。内源性大麻素(endogenous cannabinoids,eCB)是体内存在的类似天然大麻素的重要生物活性物质,已被证明对恐惧及其相关负性情绪(如焦虑等)有着双向调节作用,被认为是情绪反应的缓冲系统。已有研究表明,外源性大麻素可以抑制恐惧记忆泛化,这提示内源性大麻素系统可能参与调节了条件性恐惧记忆的泛化过程。本研究以条件性恐惧记忆泛化模型为基础,通过药理及遗传手段,明确eCB在恐惧记忆泛化过程中的具体功能,并进一步通过电生理技术,阐明eCB介导的条件性恐惧记忆泛化的神经机制。(1)改良恐惧记忆泛化模型的建立在已有的恐惧记忆泛化模型基础上进行改良,以泛化测试中“凝固行为(Freezing)”的百分比作为检测指标,分别从电刺激间隔时间、电刺激强度以及环境变化程度三个方面考察范式测试准确度,优化实验流程,最终建立简洁、稳定、可靠、有效、可重复性高的条件性恐惧记忆泛化模型,为后续实验打下坚实的实验基础。(2)eCB系统参与调控条件性恐惧记忆泛化过程腹腔注射内源性大麻素受体(cannabinoid receptor 1,CB1R)拮抗剂AM281,小鼠在恐惧记忆泛化测试中不动时间百分比显著高于对照组小鼠,辨别指数显著降低,说明AM281对小鼠的恐惧记忆泛化具有强化作用。泛化测试后CB1R的表达与对照组也有显著性差异,提示eCB系统参与调控恐惧记忆泛化。标志蛋白c-fos磷酸化检测结果证明海马是恐惧记忆泛化的关键脑区之一。(3)eCB系统和GABA通路以及谷氨酸通路协同调控恐惧记忆泛化双侧海马梯度剂量注射GABAA受体激动剂/拮抗剂以及NMDA受体NR2A亚基的拮抗剂NVP-AAM077,筛选不影响小鼠记忆泛化表达的“无效剂量”(即阈下剂量)。海马局部给药结果与腹腔注射结果一致,AM281可以强化小鼠对恐惧记忆的泛化程度,这一强化作用可被预先注射阈下剂量的GABAA受体激动剂/拮抗剂易化/消除,也可被预先注射阈下剂量的NVP逆转。以上结果表明,海马eCB系统对恐惧记忆泛化的产生具有限制作用,并可能通过GABA通路及谷氨酸通路来实现。(4)eCB系统调控条件性恐惧记忆泛化需要GABA能神经元上CB1R的激活GABA能神经元上CB1R特异性敲除小鼠表现出恐惧记忆泛化增强,而谷氨酸能神经元上CB1R特异性敲除不影响小鼠恐惧记忆的泛化程度,这一结果表明,eCB系统通过激活GABA能神经元上CB1R调节恐惧记忆泛化,并伴有CB1R等相关蛋白的表达变化。(5)恐惧记忆泛化伴随eCB相关的突触可塑性改变利用电生理技术,观察到恐惧记忆泛化测试后,海马CA3-CA1可产生高频诱导的小幅长时程增强(long-trem potentiation,LTP),GABA能神经元上CB1R特异性敲除可消除该LTP,提示eCB系统可以调节恐惧记忆泛化过程中CA1区兴奋性神经元的突触可塑性。综上所述,海马中eCB系统对恐惧记忆的泛化过程具有限制作用,可能由于eCB系统对GABA能神经元的去抑制作用,通过激活GABA能神经元上CB1R,减少GABA神经递质的释放量,间接影响海马兴奋性神经元的突触可塑性,以防止过度泛化的产生。因此,本研究对PTSD的发病机制提供了新的研究思路,为阐明eCB系统介导的条件性恐惧记忆泛化神经机制提供了大量研究数据,将有助于发现如PTSD等情绪失调疾病的新型治疗方法。