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核仁蛋白12(nucleolar protein12,NOL12)又名Nop25,是一种在脊椎动物中高度保守的核仁定位蛋白。NOL12的m RNA广泛分布于小鼠脑、肺、心脏、肾脏和脾脏等器官中。NOL12果蝇同源蛋白viriato(Vito)的m RNA在果蝇复眼强表达,我们的前期工作发现NOL12存在于大鼠视交叉神经纤维中,提示NOL12应在视网膜中表达。但目前未见NOL12是否在哺乳动物视网膜表达及其表达特征的报道。NOL12在多种细胞发挥保护性功能:在人结肠癌细胞系HCT116细胞,NOL12敲低可导致细胞凋亡,诱导DNA损伤应激反应(DNA damage response,DDR)的共济失调毛细血管扩张和Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia and Rad3related kinase,ATR)活性增强,同时细胞对氧化应激引起的DNA损伤更敏感;在果蝇唾液腺与复眼细胞,敲低NOL12同源蛋白Vito可导致细胞凋亡。但视网膜细胞中的NOL12是否具有保护作用尚不清楚。紫外线(ultraviolet,UV)辐射导致的视网膜损伤已成为视网膜变性疾病的重要病因之一,UV辐射常通过诱导DNA损伤导致视网膜神经元凋亡。UV辐射诱发DNA严重损伤时激活DDR,而ATR通路激活是DDR的起始环节。抑制ATR能够阻断因NOL12蛋白减少引起的细胞凋亡。NOL12的保护性作用与ATR通路在UV辐射诱导视网膜损伤的作用提示,NOL12在UV辐射致视网膜损伤时可能发挥保护性作用,其保护性作用可能与ATR激酶通路相关。然而,NOL12是否在UV辐射诱导的视网膜损伤时发挥保护功能,其保护性功能是否与ATR激酶通路相关尚不明确。本研究在明确NOL12是否在大鼠视网膜中表达及其表达特征的基础上,检测观察了视网膜UV辐射损伤中NOL12表达的变化,分析了NOL12的抗UV辐射损伤作用。1.NOL12在大鼠视网膜和人视网膜母细胞瘤细胞中表达免疫组织化学染色显示,成年大鼠视网膜表达NOL12;NOL2免疫反应性主要分布在视网膜神经细胞中,其中在节细胞层与视杆视锥层呈强阳性反应,在内网层与外网层呈弱阳性,其余各层弱阳性或阴性;NOL12免疫反应产物主要呈颗粒状分布在细胞质中,在细胞核内未见明显阳性反应产物。对人视网膜母细胞瘤细胞(WERI-Rb-1)进行NOL12免疫荧光染色显示,WERI-Rb-1细胞也表达NOL12;WERI-Rb-1细胞中的NOL12阳性信号主要定位于细胞核仁,在胞质中阳性信号极少;Western blot检测表明,WERI-Rb-1细胞和大鼠视网膜中的NOL12分子量大小基本一致,WERI-Rb-1细胞中的NOL12分子量略小于成年大鼠视网膜中的NOL12。NOL12在成年大鼠;视网膜细胞和WERI-Rb-1细胞中的分布位置差异提示其可能细胞分化有关。2.UV辐射通过下调NOL12水平损伤视网膜细胞NOL12能够对果蝇复眼细胞和HCT116细胞产生保护性作用,而UV辐射造成细胞损伤时常伴随保护性蛋白水平下调。为明确视网膜中NOL12是否具有抗UV辐射损伤作用,首先检测了UV辐射对视网膜内和WERI-Rb-1细胞中NOL12表达的影响。Western blot检测显示,UV照射后,视网膜内和WERI-Rb-1细胞中激活型Caspase-3水平明显增加的同时,NOL12水平显著下降。由于Real-time PCR分析发现,UV辐射后,大鼠视网膜与WERI-Rb-1细胞中NOL12 m RNA水平不仅没有降低,反而显著增高,说明UV辐射时NOL12水平的下降并非表达减少引起,而是因为被大量降解所致。由此提示,UV辐射可能通过降低具有保护作用的NOL12水平产生细胞凋亡,导致视网膜损伤。为证明这一假设,进一步观察了下调NOL12表达对视网膜细胞凋亡的影响和上调NOL12表达对UV辐射所致的视网膜细胞凋亡的影响。Western blot、细胞核Hoechst 33258染色及Annexin V-PI流式细胞术分析显示,在以小分子干扰RNA沉默NOL12表达的WERI-Rb-1细胞中,激活型Caspase-3水平升高,同时核碎裂细胞比例增高,而在WERI-Rb-1细胞中过表达NOL12,可明显抑制UV辐射所致的Caspase-3激活、核碎裂细胞比例增高和死亡细胞与晚期凋亡细胞百分比的增加。由此证明,NOL12具有抑制细胞凋亡的保护作用,UV辐射可通过下调NOL12水平,削弱其保护作用而诱导细胞凋亡,导致视网膜损伤。3.NOL12通过抑制ATR激酶通路抑制视网膜细胞UV辐射损伤为明确NOL12在视网膜中的保护性作用是否是通过影响ATR激酶通路实现,我们检测了改变NOL12表达水平和UV辐射对WERI-Rb-1细胞内ATR激酶含量的影响、抑制ATR激酶活性对沉默NOL12和UV辐射所致的WERI-Rb-1细胞凋亡的影响以及过表达ATR激酶对过表达NOL12抑制UV辐射所致的WERI-Rb-1细胞凋亡的影响。Western blot检测显示,过表达NOL12对WERI-Rb-1细胞ATR激酶的含量无明显影响,而沉默NOL12和UV照射则显著上调WERI-Rb-1细胞ATR激酶水平;ATR激酶特异性抑制剂VE822处理能够抑制沉默NOL12和UV辐射引起的WERI-Rb-1细胞内激活型Caspase-3水平升高;单独过表达NOL12对UV辐射所引起的激活型Caspase-3增加和核碎裂细胞比例增加的显著抑制可被共同过表达ATR激酶所减弱。由此表明,UV辐射使NOL12蛋白减少所导致的细胞凋亡通过激活ATR激酶通路完成,NOL12可通过抑制ATR激酶通路对抗UV辐射,保护视网膜细胞。.结论:NOL12在大鼠视网膜节细胞层、视杆视锥层、内网层与外网层细胞胞质表达;UV辐射导致NOL12蛋白水平降低,从而诱发细胞凋亡;UV辐射导致视网膜损伤时,NOL12的保护性作用与抑制ATR激酶通路有关。